ENHANCED INVESTIGATION OF ETIOLOGY OF DISEASES DURING THE SHIGELLOSIS OUTBREAK WITH FATAL OUTCOMES AMONG CHILDREN

N. V Parkina; Паркина Наталья Владимировна; E. V Sakalkina; Сакалкина Екатерина Викторовна; A. N Guseva; Гусева Анна Николаевна; K. V Kuleshov; Кулешов Константин Валерьевич; T. A Olneva; Ольнева Татьяна Александровна; I. A Goptar; Гоптарь Ирина Александровна; E. A Domonova; Домонова Эльвира Алексеевна; S. V Matosova; Матосова Светлана Владимировна; O. Yu Silveystrova; Сильвейстрова Ольга Юрьевна; N. A Khromova; Хромова Наталья Анатольевна; Alexander T. Podkolzin; Подколзин Александр Тихонович; G. A Shipulin; Шипулин Герман Александрович

doi:10.17816/EID41010

ENHANCED INVESTIGATION OF ETIOLOGY OF DISEASES DURING THE SHIGELLOSIS OUTBREAK WITH FATAL OUTCOMES AMONG CHILDREN

Authors: Parkina N.V¹, Sakalkina E.V¹, Guseva A.N¹, Kuleshov K.V¹, Olneva T.A¹, Goptar I.A¹, Domonova E.A¹, Matosova S.V¹, Silveystrova O.Y.¹, Khromova N.A¹, Podkolzin A.T.¹, Shipulin G.A¹
Affiliations:
1. Central Research Institute for Epidemiology
Issue: Vol 22, No 6 (2017)
Pages: 311-319
Section: Articles
Submitted: 23.07.2020
Published: 15.12.2017
URL: https://rjeid.com/1560-9529/article/view/41010
DOI: https://doi.org/10.17816/EID41010
ID: 41010

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

The outbreak of shigellosis caused by Shigella. flexneri 2a which affected a total of 42 persons was revealed by epidemiological analysis and microbiological testing in a nursing home for disabled children with a severe pathology of the nervous system. At the same time, four fatal cases among children were registered. The main purpose of our study was to perform an enhanced investigation to find potentially novel etiological agent among affected persons especially in cases with fatal outcome. We applied a broad range of commercial kits based on the nucleic acid amplification techniques as well as bacteriological methods for etiological diagnosis. Additionally, several S. flexneri 2a isolates and revealed bacterial pathogens were subjected to pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) and Whole Genome Sequencing (WGS) for expanded genetic characterization as well as demonstration of their clonality and the presents/absence of unusual pathogenic determinants. Genetic relationship between viral pathogens was characterized by Sanger sequencing of phylogenetically informative regions. Epidemiological data and lab testing allowed considering the generalized herpes simplex virus type 1 infection (HSV-1) to be a possible cause of fatal cases.

Keywords

HSV-1, shigellosis, healthcare-associated infections (HAIs), herpes simplex virus type 1 (HSV-1)

Full Text

Введение Летальные исходы в очагах групповой заболеваемости диарейными инфекциями являются экстраординарным событием, требующим детального изучения всех возможных факторов риска их развития. Эти факторы могут быть обусловлены как уникальными свойствами патогена, вызвавшего вспышку, так и иметь совершенно иную природу, требующую расширенного анализа лабораторных и эпидемиологических данных. Представленное наблюдение иллюстрирует возможность сочетания внебольничной вспышки кишечной инфекции с внутрибольничной инфекцией, ассоциированной с развитием летальных исходов у пострадавших. Материалы и методы Описание очага. Фоновая вспышка развилась в детском доме-интернате для детей с тяжёлой врождённой патологией центральной нервной системы (ЦНС). Первый случай заболевания зарегистрирован 24.07.2016 г. В период до 11.08.2016 г. заболел 31 ребенок и 11 сотрудников интерната. Были госпитализированы 23 ребенка. Изоляты S. flexneri 2a выявлены у 15 детей (всего пострадавших - 31 ребёнок), и ДНК Shigella spp./EIEC (энтероинвазивные E. coli) - в фекалиях 23 из 27 обследованных детей. В период с 24.07.2016 г. по 11.08.2016 г. пострадавших госпитализировали в инфекционное отделение районной муниципальной больницы, после 13.08.2016 г. пациентов перевели в областную больницу. Четыре ребёнка, у которых впоследствии наступил летальный исход, были госпитализированы в инфекционное отделение районной муниципальной больницы в период с 27.07.2016 г. по 03.08.2016 г. Трое из них (Р1, Р2 и Р4) находились в одной палате, пациент Р3 в отдельном боксе (рис. 1). Все умершие пациенты имели в качестве основного заболевания тяжёлую неврологическую патологию (органические поражения головного мозга, врождённые пороки развития ЦНС). Прижизненно, на основании записей в историях болезней, у данных пациентов были верифицированы разные ведущие клинические синдромы, определявшие тяжесть их состояния (табл. 1). Лабораторные исследования. Для установления этиологии вспышки кишечной инфекции использовали бактериологическую диагностику и набор реагентов Amplisens® ОКИ скрин-FL. Идентичность штаммов S. flexneri 2a оценивали с применением метода макрорестрикционного анализа с разделением продуктов рестрикции в пульсирующем электрическом поле (PFGE) с использованием эндонуклеаз рестрикции XbaI и NotI, использованием стандартных протоколов Международной сети по надзору за кишечными инфекциями PulseNet (http://www.pulsenetinternational.org/). Для характеристики генетических детерминант факторов вирулентности изолятов S. flexneri 2a, а также определения филогенетических отношений с ранее секвенированными геномами проводили полногеномное секвенирование. ДНК-библиотеки готовили с применением набора реагентов Nextera («Illumina», США) с последующим секвенированием на приборе MiSeq («Illumina», США) в виде парно-концевых прочтений 2 × 250 п.о. В качестве геномов для сравнения использовалась выборка из 354 изолятов S. flexneri различных серотипов (Xv, X, 2a, 2b, 1b, 3a, 4av, Y, 3b, 4a, 1a, Yv, 1c, 1c, 4bv, 5b, 5a, 4b, 1cv), которые были ассоциированы со случаями дизентерии в различных регионах мира на протяжении 1913-2011 гг. [1]. Филогенетический анализ базировался на определении матрицы высококачественных единичных однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) путём картирования нуклеотидных прочтений каждого из геномов на референс-геном S. flexneri 2a str. 301, согласно ранее разработанному алгоритму анализа [2]. Полученную SNP-матрицу использовали для последующей реконструкции филогенетического дерева с использованием пакета программ PhyML v 3 методом максимального правдоподобия (Maximum Likelihood tree). Оценка идентичности изолятов патогенов вирусной природы проводилась с применением методик секвенирования по Сэнгеру информативных для филогенетического анализа участков их генома. Для исследования аутоптатов от умерших пациентов наряду с культуральной диагностикой использовали следующие наборы реагентов: АмплиСенс® EBV/CMV/HHV6-скрин-FL (№ ФСР 2010/09502 от 15.05.2012); АмплиСенс® Enterovirus-FL (№ ФСР 2008/02264 от 29.07.2014); АмплиСенс® HSV I, II-FL (№ ФСР 2007/00827 от 18.11.2011); АмплиСенс® Influenza virus A/B-FL (№ ФСР 2009/05010 от 12.10.2012); АмплиСенс® Legionella pneumophila-FL (№ ФСР 2010/07097 от 18.11.2011); АмплиСенс® Listeria monocytogenes-скрин/монитор-FL (№ РЗН 2015/3111 от 18.09.2015); АмплиСенс® MRSA-скрин-титр-FL (№ ФСР 2012/13998 от 29.10.2012); АмплиСенс® N. meningitidis/H. influenzae/S. pneumoniae-FL (№ ФСР 2011/12380 от 25.11.2011); АмплиСенс® Salmonella typhi-FL (№ ФСР 2010/07826 от 18.11.2011); АмплиСенс® Vibrio cholerae-FL (№ ФСР 2011/11139 от 04.05.2012); АмплиСенс® Yersinia enterocolitica/pseudotuberculosis-FL (№ ФСР 2010/07830 от 18.11.2011); АмплиСенс® ОКИ скрин-FL (№ ФСР 2008/02265 от 17.11.2011); АмплиСенс® ОРВИ-скрин-FL (№ ФСР 2011/11258 от 22.07.2011); АмплиСенс® Эшерихиозы-FL (№ ФСР 2010/07977 от 18.11.2011); АмплиСенс® MDR KPC/OXA-48-FL (№ РЗН 2013/879 от 12.07.2013); АмплиСенс® MDR MBL-FL (№ РЗН 2013/729 от 01.07.2013); методики выявления генов карбапенемаз (MDR Ab-OXA) и бета-лактамаз расширенного спектра (MDR ESBL CTX-M), C. difficile ТОКСИН А+В Тест («Novamed», Израиль) (РУ № ФСЗ 2011/09636). Для выявления возможной внутрибольничной циркуляции патогенов проведено исследование назогастральных зондов и препарата, использовавшегося для энтерального питания детей, смывов с посуды, поверхностей столов, тумбочек, пеленальных столов, стен, спинок кроватей, дверных ручек, смесителей, ручек телефонов, клавиатур. Результаты Анализ антибиотикорезистентности и молекулярно-генетическое субтипирование изолятов S. flexneri 2a. Исследуемые изоляты имели резистентность к цефотаксиму, норфлоксацину, цефуроксиму, ципрофлоксацину, ампициллину, налидиксовой кислоте, стрептомицину, тетрациклину (спектр по EUCAST и/ или CLSI). Девять исследованных изолятов S. flexneri 2a имели идентичный PFGE-паттерн при использовании XbaI- и NotI-рестриктаз (JZXX01.0017 JZXN11.0004) (рис. 2). Полученная комбинация PFGE-профилей являлась уникальной в сравнении с имеющимися сведениями по локальной базе данных. Непосредственное сравнение набора выявленных SNP между вспышечными изолятами показало, что количество различий по SNP при попарном сравнении геномов варьирует в узких пределах - 3-8 SNP, что, с одной стороны, указывает на наличие уникальных характеристик для каждого из изолятов, а с другой - подтверждает клональность изолятов, т. е. принадлежность изолятов к одному групповому очагу заболевания. Полногеномный филогенетический анализ с ранее секвенированными геномами S. flexneri позволил показать, что группа изолятов из данного очага формирует уникальную монофилетическую ветвь среди поздних секвенированных геномов S. flexneri, принадлежащих к филогруппе 3 (PG3). Наиболее близкими к исследуемым изолятам являются изоляты, выделенные в Бангладеш в 2009-2010 гг., что свидетельствует о принадлежности данных штаммов к азиатскому генотипу (рис. 3). Анализ представленности генов факторов вирулентности в геномах изученных изолятов не позволил выявить уникальных факторов, способных объяснить высокий риск развития летальных исходов у нескольких пострадавших. Для всех изолятов характерно присутствие двух островов патогенности: острова патогенности шигелл 1 (SHI-1) и острова патогенности шигелл 2 (SHI-2). Дополнительно выявлен ряд генов, кодирующих второстепенные факторы вирулентности, к которым относились кластер генов, кодирующих систему транспорта железа (sitABCD), оперон, ответственный за биосинтез энтеробактина (entABECFD, fepABCDG), и оперон генов, кодирующих белки адгезии к эпителиальным клеткам (fimCDEFGHIB). Каких-либо характерных генетических преобразований данных регионов выявлено не было. Поиск и исследование дополнительных этиологических агентов - возможной причины летальных исходов. Группировка летальных исходов по территориальному (в пределах одного отделения) и временному (в течение 9 сут) признаку требовала исключения инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи (ИСМП). Таким образом, исследование аутопсийного материала было направлено на выявление общих патогенов, которые могли иметь потенциальную ассоциацию с неблагоприятным исходом болезни. Положительные результаты тестирования обобщены в табл. 2. Комбинированное применение бактериологических исследований и методов амплификации нуклеиновых кислот (МАНК), направленных на детекцию генетических детерминант антибиотикорезистентности, позволило сузить спектр условно-патогенной микрофлоры до группы метициллинрезистентных стафилококков. У двух пациентов были выявлены различные виды стафилококков - S. aureus и S. epidermidis. У двух других пациентов (Р3 и Р4) - S. haemolyticus. Однако при оценке идентичности изолятов S. haemolyticus с использованием метода PFGE (по рестриктазе SmaI) между ними были выявлены достоверные различия (данные не представлены), что свидетельствовало об отсутствии эпидемиологической связи между данными случаями (данные не представлены). Другим патогеном, выявленным у всех умерших пациентов, был HSV-1 (вирус простого герпеса 1-го типа). ДНК HSV-1 детектирована в образцах аутопсийного материала в высоких концентрациях у всех умерших пациентов (см. табл. 2). Также ДНК HSV-1 выявлена в образцах слюны у трёх из 167 сотрудников интерната и детей, не находившихся на госпитализации (в низкой концентрации). Для оценки идентичности изолятов HSV-1 использовали секвенирование области US-4 гена гликопротеина G, с использованием методики, описанной ранее [3]. Для оценки естественной гетерогенности циркулирующих штаммов HSV-1 в сравнение включили 3 изолята, выделенные от сотрудников интерната (не находившихся на госпитализации в стационаре) и 4 изолята от лиц с герпесвирусной инфекцией в другом регионе (г. Москва). Все изоляты HSV-1 от умерших пациентов относились к геногруппе В/С, в то время как остальные включённые в исследование изоляты - к группе А. Субвидовая характеристика данных изолятов показала их идентичность на изучаемом участке генома (585 п.н.о. участка US-4 гена гликопротеина G). Результаты филогенетического анализа HSV-1 представлены на рис. 4. При исследовании смывов с оборудования и мебели инфекционного отделения стационара, в которое госпитализировали детей, образцов препарата, использовавшегося для энтерального питания, и назогастральных зондов ДНК HSV-1 выявлена не была. Обсуждение Этиология основной вспышки диарейного заболевания, послужившей поводом для госпитализации пациентов, не вызывала сомнений. Однако шигеллёз, обусловленный S. flexneri 2a, не мог объяснить летальные исходы у четверых пострадавших, несмотря на сопутствующую неврологическую патологию. Тяжёлое течение диарейных инфекций с относительно поздним развитием летальных исходов - на 8-17-й день заболевания, может быть вызвано развитием гемолитико-уремического синдрома (ГУС). Наиболее частой этиологической причиной ГУС, развившегося после эпизода диареи в анамнезе, являются инфекции, вызванные Stx 1/2-продуцирующими штаммами эшерихий и шигелл. Среди шигелл способность к продукции шигоподобных токсинов является наиболее типичной для S. dysenteriae 1-го типа. Несмотря на отсутствие объективных указаний на наличие у пациентов ГУС, с учётом приведённых в литературе данных о возможности продукции шигоподобных токсинов другими видами шигелл, представлялось необходимым исключить данную особенность у вызвавших вспышку штаммов [4-6]. Потенциальная способность к продукции шигоподобных токсинов была исключена как применением наборов реагентов для специфической детекции генов Stx 1-го и 2-го типов, так и данными полногеномного секвенирования, подтвердившими отсутствие в геномах данных изолятов гомологов указанных генов. Более того, анализ факторов вирулентности шигелл не позволил выявить их уникальных комбинаций, которые потенциально могли обусловливать атипично тяжёлое течение заболеваний. Таким образом, возникла необходимость выявления других общих для данных пациентов патогенов, которые могли иметь связь с неблагоприятным исходом заболеваний. Для решения данной задачи проведён широкий спектр лабораторных исследований, основу которого составляли амплификационные тесты. В аутоптатах всех пациентов выявлены генетические маркеры (ген mecA) метициллинрезистентных стафиллококков. Однако их видовая и субвидовая (PFGE) характеристика показала гетерогенность данных изолятов, что не позволяло рассматривать их как общий фактор, действовавший на умерших пациентов, и делало маловероятной их ведущую роль в развитии летальных исходов. Единственным представителем герпесвирусов, выявленным посмертно у всех умерших детей, был HSV 1-го типа. Все изоляты HSV-1 от умерших пациентов отличались от всех других исследованных в данной работе, были идентичны между собой и идентичны выделенному от пациента с летальным исходом на фоне герпесвирусного трахеобронхита и пневмонии при описанной ранее вспышке в кардиоторакальном отделении в Германии (пациент I7, GenBank Accession number EF376318) [7]. Широко распространено мнение о частом выявлении маркеров герпесвирусных инфекций у клинически здоровых лиц. Однако детекция ДНК HSV-1 в материале от клинически здоровых лиц наблюдается достаточно редко. Это подтверждается результатами исследования образцов из респираторного тракта от 167 сотрудников и воспитанников интерната, не имевших в анамнезе госпитализаций в инфекционный стационар, при котором ДНК HSV-1 выявлена только в 3 случаях (Р 24568, Р 24662, Р 24707) (см. рис. 4). Для оценки частоты выявления ДНК HSV-1 в аналогичных образцах аутопсийного материала проанализированы результаты исследования проведённого совместно ФБУН «ЦНИИ Эпидемиологии» Роспотребнадзора и ГБУЗ «Морозовская ГДКБ» ДЗМ в Москве [8]. При исследовании аутопсийного материала детей (n = 101) с подозрением на ранний и поздний неонатальный сепсис, умерших в возрасте до года, ДНК HSV-1 не выявлена ни в одном из проанализированных образцов. Максимальные концентрации (минимальные значения Ct) ДНК HSV-1 обнаружены у умерших пациентов в аутоптатах лёгких и селезёнки. Значения Ct, выявленные в данных образцах у пациентов Р2, Р3 и Р4, были существенно выше (Ct 8-18), чем обычно детектируемые аналогичным набором реагентов в клинических образцах (образцы спинномозговой жидкости, содержимого везикул, респираторные мазки: 30,34 ± 5,12 (Mean ± SD; n = 286), по данным клинико-диагностической лаборатории отдела молекулярной диагностики и эпидемиологии ФБУН «ЦНИИ Эпидемиологии» Роспотребнадзора). Более низкие концентрации ДНК HSV-1 выявлены у пациента Р1, что может быть связано с проведением исследования после эксгумации трупа на 5-й день после захоронения. При оценке возможности внутрибольничного инфицирования HSV-1 необходимо принимать во внимание среднюю длительность инкубационного периода при этом заболевании. При описанных вспышках, вызванных HSV-1, на 5-й день заболевание развивалось у 27-55% инфицированных, на 7-й день - у 73% и на 8 день - у 91-93% [9]. В нашем исследовании у первого пациента летальный исход наступил на 8-й день пребывания в стационаре, у остальных трёх детей - спустя 7, 8 и 9 дней после первого случая (см. рис. 1). Таким образом, можно предполагать различные сроки вероятного инфицирования. С учётом хронологии госпитализаций и наступления летальных исходов, возможным источником инфицирования для пациентов Р2, Р3 и Р4 был пациент Р1. Заключение Полученные результаты согласуются с клиническими наблюдениями других авторов, описывающих развитие внутрибольничных вспышек герпесвирусных инфекций в форме пневмоний и геморрагического трахеобронхита, сопровождающихся высокой летальностью (у 7 из 8 пострадавших пациентов) [7]. Данное наблюдение явилось примером того, как комплекс эпидемиологических данных и результатов лабораторных исследований позволил установить наиболее вероятную роль герпесвирусной инфекции, вызванной HSV 1-го типа, в развитии летальных исходов у четырёх пациентов, что заставляет более широко оценивать потенциальный спектр возбудителей, обусловливающих возможность возникновения инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи и способных определять прогноз заболевания [1].