In vitro study of the bactericidal activity for new derivatives of quaternary ammonium salts based on pyridoxine against gram-positive/gram-negative bacteria

Mariya  N. Agafonova; Агафонова Мария Николаевна; Elizaveta  D.  Kobylinskaia; Кобылинская Елизавета Дмитриевна; Elena  S.  Bulatova; Булатова  Елена  Сергеевна; Alina S.  Biktimirova; Биктимирова Алина  Сергеевна; Sergey V.  Sapozhnikov; Сапожников  Сергей  Витальевич; Nikita V. Shtyrlin; Штырлин Никита  Валерьевич; Yurii G.  Shtyrlin; Штырлин Юрий  Григорьевич

doi:10.17816/EID624847

Исследование бактерицидной активности новых производных четвертичных аммониевых солей на основе пиридоксина in vitro в отношении грамположительных/грамотрицательных бактерий

Авторы: Агафонова М.Н.¹, Кобылинская Е.Д.¹, Булатова .С.², Биктимирова А.С.², Сапожников ..², Штырлин Н.В.³, Штырлин Ю.Г.²
Учреждения:
1. Казанский (Приволжский) Федеральный Университет
2. Казанский (Приволжский) федеральный университет
3. "Казанский (Приволжский) федеральный университет"
Раздел: ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
URL: https://rjeid.com/1560-9529/article/view/624847
DOI: https://doi.org/10.17816/EID624847
ID: 624847

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ
Доступ закрыт

Доступ предоставлен
Доступ закрыт

Доступ платный или только для подписчиков

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Обоснование: профилактика и успешное лечение инфекционных заболеваний, в том числе внутрибольничных инфекций, относятся к числу важнейших задач современного здравоохранения. Для решения этой проблемы существует не так много эффективных антисептиков и дезинфектантов. Четвертичные аммониевые соли на сегодняшний день являются одним из перспективных классов дезинфицирующих средств, однако их применение ограничивается способностью микроорганизмов вырабатывать устойчивость к данным соединениям. Модификация ЧАС заместителями различной природы является возможным путем решения данной проблемы.

Цель исследования: в данной работе проведен сравнительный анализ бактерицидной активности двух оригинальных низкомолекулярных соединений на основе пентаэритрита в сравнении с хлоридом бензалкония.

Материалы и методы: бактерицидные свойства 0.1% и 0.2% водных растворов оригинальных ЧАС на основе пиридоксина были исследованы в отношении двух широко распространенных возбудителей S. aureus и E. coli; данные об антибактериальной активности получены с помощью стандартного теста in vitro (исследование бактерицидной активности на поверхности металла, время экспозиции 1, 5 и 15 минут). В дополнении к стандартным условиям, бактерицидные свойства также были изучены в условиях добавления белковой нагрузки (в виде раствора БСА).

Результаты: В ходе исследования было показано, что для изучаемых соединений RF – фактор редукции (снижение log10 КОЕ микроорганизмов) в среднем ≥ 3. Усложнение модельных условий в виде белковой нагрузки приводило к снижению эффективности на 1-3 порядка. Мы также наблюдали интересный эффект изменения специфичности в зависимости от времени воздействия.

Заключение: Полученные результаты показали высокую активность исследуемых соединений (соответствуют критерию эффективности RF≥3, предъявляемому для коммерческих соединений, используемых в данной области).

Ключевые слова

дезинфектанты, бензалкония хлорид, бактерицидная активность, тест на поверхности.

Полный текст

Введение

Антисептики и дезинфектанты являются неотъемлемыми компонентами не только поддержания личной гигиены, но и контроля над возникновением и распространением различных инфекционных заболеваний, внутри- и внебольничных инфекций [1, 2]. В качестве представителей можно выделить класс четвертичных аммониевых солей (ЧАС), а среди представителей данного класса – бензалкония хлорид [3;4]. Бензалкония хлорид – широко используемое дезинфицирующее средство и консервант, однако следует отметить его токсичность и сильное раздражающие действие на кожу и слизистые человека, кроме того из-за широкого применения и попадания бензалкония хлорида в окружающую среду к данному препарату наблюдается постепенное снижение чувствительности бактерий [5]. Модификация ЧАС заместителями различной природы является возможным путем решения данной проблемы. Следует отметить, что в литературе отсутствуют систематические сравнительные данные об эффективности антисептиков, которые были бы получены по единым стандартизированным методикам, кроме того, нормативные стандарты, принятые для использования в разных странах, могут различаться, и, наконец, эксперименты в условиях, приближенных к реальным, как правило остаются на усмотрение разработчиков [6]. Нельзя не упомянуть, что многие исследования проводятся с использованием спиртовых растворов антисептиков или их смесей/композиций [7, 8, 9], что зачастую непригодно для объективной оценки биоцидных свойств самих оригинальных соединений. В настоящей работе мы постарались учесть эти особенности при изучении свойств тестируемых соединений.

Целью исследования являлось проведение сравнительного анализа бактерицидной активности модифицированных ЧАС на основе пиридоксина содержащих три и более аммониевых фрагмента, в лабораторном тесте на металлической поверхности in vitro.

Исследуемые соединения получены используя пентаэритрит как синтетически удобную и доступную платформу:

- соединение 1: 1,3-бис(8-диметил(децил)аммоний)метил)-1,5-дигидро-[1, 3]диоксепино[5, 6-с]пиридин)-9-окси)-2,2-бис((8-диметил)децил)аммоний)метил)- 1,5-дигидро-[1, 3]диоксепино[5,6-с]пиридин-9-окси)метил)пропан тетрахлорида;

- соединение 2: 1-метил-2,2-бис(8-((диметил(децил)аммоний)метил)-1,5-дигидро-[1, 3]диоксепино[5,6-c]пиридин-9-окси)метил)-3-(8 ((диметил(децил)аммоний)метил)-1,5-дигидро-[1, 3]диоксепино[5,6-c]пиридин-9-окси)пропан трихлорида.

Ранее для аналогов приведенных соединений нами было показано, что наряду с антибактериальной эффективностью они обладают более благоприятным профилем безопасности по сравнению с хлоридом бензалкония (БХ) [10]. Это позволило нам предположить, что соединения могут проявлять антибактериальную активность не только в суспензионных тестах, но также могут являться перспективными дезинфицирующими средствами.

Методы

Дизайн исследования

Сравнительную оценку дезинфицирующего действия проводили на музейных штаммах Staphylococcus aureus ATCC 209p и Escherichia coli CDCF-50. Бактериальные штаммы получены из Казанского института эпидемиологии и микробиологии (Казань, Россия).

Бульон Мюллера-Хинтон готовили из сухих сред (Mueller Hinton broth, Acumedia, Baltimore), культивирование осуществляют на агаризованной среде Мюллера-Хинтон, которая включает дополнительно 2% агара. Среды стерилизовали автоклавированием при 121^оС в течение 15 минут.

В состав нейтрализующего раствора входили следующие компоненты: 8% Tween80, 6% сапонин, 0.8% лецитин, 2% SDS, PBS),

Определение дезинфицирующей активности на контаминированной металлической поверхности

Тест проводили в соответствии с европейскими рекомендациями по тестированию химических дезинфицирующих средств и антисептиков [6, 11-16, 17]. Для приготовления бактериальной суспензии культуры микроорганизмов, выращенные на плотной питательной среде Мюллера-Хинтона в течение 18 – 24, смывали стерильным изотоническим раствором хлорида натрия. Бактериальную суспензию каждого микроорганизма доводили до мутности, соответствующей 3 единицам Мак-Фарланда. Одновременно для моделирования условий контаминаминированной поверхности таким же образом готовили инокулят с добавлением бычьего сывороточного альбумина (конечная концентрация 0.4%). Для оценки чувствительности бактерий к испытуемым соединениям на предварительно очищенную металлическую поверхность (нержавеющая сталь AISI типа 304, расчерченная на квадраты 5×5 см) наносили микробную взвесь (содержащую и не содержащую БСА) в объеме 0.125 мл, и распределяли стерильным шпателем по всей площади квадрата. После высыхания наносили 0.5 мл испытуемых соединений и препарата сравнения (концентрация 0.1% и 0.2%) и распределяли по поверхности квадрата стерильным шпателем. Выдерживали 1, 5 и 15 мин при 25 °С. После окончания экспозиции стерильной марлевой салфеткой, смоченной в растворе нейтрализатора (объем 1 мл), тщательно протирали контаминированную поверхность и погружали салфетку в 10 мл стерильного физиологического раствора, встряхивали в течение 10 минут. Далее проводили посев жидкости на плотную питательную среду, культивирование осуществляли 24-48 часов при 37 ^оС. КОЕ тест-микроорганизмов подсчитывали через 24 или 48 ч инкубации при 37 °С. Параллельно делали несколько контролей: контроль жизнеспособности микроорганизма; контроль стерильности раствора дезинфектанта; контроль полноты нейтрализации дезинфектанта; контроль стерильности поверхности. Коэффициент редукции (RF) – снижения КОЕ log10 для каждого времени контакта рассчитывали по формуле:

RF = log₁₀n_c – log₁₀n_d

где n_c – количество жизнеспособных клеток (КОЕ) в контроле; n_d –количество жизнеспособных клеток (КОЕ) после воздействия тестируемых соединений.

Методы статистического анализа данных: Статистическую обработку результатов проводили с использованием редактора Microsoft Excel и программы Graph PadPrism. Для показателей рассчитывали средние арифметические значения и стандартные отклонения.

Основной исход исследования: Согласно нормативам критерием эффективности является 3 ≥ RF ≥5 [5, 6, 11-16] в зависимости от конкретной области применения.

Результаты

Дезинфицирующую активность исследуемых соединений 1 и 2 на поверхности металла исследовали с помощью количественного лабораторного теста in vitro. Металлические поверхности контаминировали тест-культурами (S. aureus и E. coli), затем высушивали и обрабатывали исследуемыми веществами в концентрациях 0.1% и 0.2% в течение 1, 5 и 15 минут. Следует отметить, что при проведении исследований для усложнения условий также использовали микробную взвесь, содержащую белок – бычий сывороточный альбумин (БСА). Используемые параметры моделируют дезинфицирующую активность веществ в более жестких условиях по сравнению с тестом в пробирке (суспензионный тест), поскольку на высушенной поверхности происходит адгезия микроорганизмов, что снижает активность антисептиков/дезинфектантов [18;19].Согласно полученным результатам в концентрации 0.1% наиболее значимое снижение колониеобразующих единиц (КОЕ) S. aureus наблюдалось после 15-минутного воздействия (RF = 6.3 – 6.6) (табл. 1). При уменьшении времени воздействия до 5 минут наблюдаемый эффект исследуемых соединений сопоставим с препаратом сравнения. Однако при воздействии в течение 1 минуты исследуемые соединения уступают препарату сравнения (RF = 4.08, 4.15 и 5.49 для соединений 1, 2 и БХ соответственно). Введение БСА снижало активность всех веществ примерно в 1.3-1.5 раза. Однако увеличение концентрации до 0.2% приводило к увеличению значений RF во всех исследованных образцах в среднем на 1-2 лог. ед.В целом можно заключить, что аналогичная тенденция наблюдалась и после воздействия изучаемых соединений на E. coli (табл. 2). Полное подавление роста бактерий наблюдалось через 15 минут обработки независимо от используемой концентрации (0.1% или 0.2%). Та же активность была продемонстрирована после 5-минутного воздействия в концентрации 0.2%. Интересно отметить, что уменьшение времени воздействия для концентрации 0.1% (до 1 и 5 минут) приводило к резкому снижению антибактериальной активности в 1.6-2 раза. После добавления БСА полное подавление роста было показано только в случае концентрации 0.2% и лишь в случае для максимального времени воздействия (15 минут). В целом добавление БСА снижало антибактериальную активность на 0.2-3 порядка. Таким образом, максимальный эффект для исследуемых соединений наблюдается в концентрации 0.2% и времени воздействия не менее чем 5 минут. Следует отметить, что введение белковой нагрузки в большинстве случае снижает активность соединений, но при этом их эффективность сопоставима с эффективностью препарата сравнения. Также наблюдаемая активность обоих исследуемых соединений в отношении E. coli и S. aureus практически одинакова.

Таблицы

Таблица 1. Величины коэффициента редукции (RF) для исследуемых соединений и препарата сравнения в отношении S. aureus при различных концентрациях и времени инкубации .

Исследуемые соединения	Время инкубации (мин)
	1		5		15
	–БСА	+ БСА	– БСА	+ БСА	– БСА	+ БСА
БХ, 0.1%*	5.49±0.11	3.77±0.07	5.51±0.1	4.84±0.21	6.58±0.14	4.92±0.12
БХ, 0.2%**	6.41±0.12	4.19±0.14	7.41±0.11	5.81±0.15	7.41±0.10	6.49±0.22
Соединение 1, 0.1%*	4.08±0.14	3.04±0.16	5.24±0.12	4.78±0.18	6.42±0.12	4.44±0.12
Соединение 1, 0.2%**	5.26±0.11	4.12±0.14	6.98±0.11	5.62±0.14	7.41±0.14	6.52±0.16
Соединение 2, 0.1%*	4.15±0.14	3,46 ±0.14	4.64 ±0.12	4.12 ±0.15	6.34±0.15	4.78±0.14
Соединение 2, 0.2%**	5.32±0.12	4.07±0.14	6.14 ±0.12	4.98 ±0.14	7.41±0.12	6.38±0.16

*lg КОЕ в контроле – 9.00; **lg КОЕ в контроле – 7.41.

Таблица 2. Величины коэффициента редукции (RF) для исследуемых соединений и препарата сравнения в отношении E. coli при различных концентрациях и времени инкубации.

Исследуемые соединения	Время инкубации (мин)
	1		5		15
	–БСА	+ БСА	– БСА	+ БСА	– БСА	+ БСА
БХ, 0.1%*	3.62±0.18	3.44±0.18	4.92±0.20	3.93±0.18	8.16±0.22	5.38±0.14
БХ, 0.2%**	5.97±0.12	4.61±0.15	8.09±0.11	6.01±0.12	8.09±0.12	8.09±0.21
Соединение 1, 0.1%*	3.25±0.16	3.03±0.16	4.12±0.18	3.44±0.14	8.16±0.14	5.04±0.16
Соединение 1,0.2%**	5.33±0.14	4.28±0.12	8.09±0.12	5.32±0.15	8.09±0.14	8.09±0.12
Соединение 2, 0.1%*	3.15±0.18	3.00±0.16	3.92±0.16	3.04±0.11	8.16±0.18	4.96±0.18
Соединение 2,0.2%**	4.63±0.15	3.85±0.14	8.09±0.12	4.89±0.14	8.09±0.14	8.09±0.12

*lg в контроле – 8.16; **lg КОЕ в контроле – 8.09.

Обсуждение

Анализ результатов дезинфицирующей активности исследуемых соединений выявил, что после воздействия в течение 15 минут исследуемые соединения более специфично подавляют рост E. coli, а не S. aureus как это можно было бы изначально предположить. Хотя при краткосрочном действии (1 минута) оба соединения демонстрируют повышенную активность именно против S. aureus как в концентрации 0.1% так и 0.2%. Характер активности сохраняется и при добавлении БСА. Таким образом, мы можем заключить, что ведение белковой нагрузки хотя и затрудняет работу, но не оказывает существенного влияния на специфичность исследуемых соединений. Единственное отличие от экспериментов, проводимых в отсутствии БСА заключается в том, что соединения теряют специфичность по отношению к S. aureus уже после экспозиции в течении 1-й минуты. Механизмы наблюдаемого эффекта на данном этапе не вполне ясны. Можно предположить, что это связано со снижением проницаемости молекул для S. aureus в случае когда клетки находится в состоянии адгезии. Предположительно, высушенные клетки S. aureus образуют более компактные и плотные структуры, более устойчивые к действию антисептиков/дезинфектантов. Напротив, клетки E. coli образуют менее плотные структуры, более чувствительные к действию биоцидов в аналогичных условиях.В частности ранее была показана повышенная чувствительность E. coli к высыханию по сравнению с S. aureus [20]. Так как в данной работе изучены только два штамма бактерий следует подчеркнуть, что данный эффект может быть связан не со всеми грамположительными и грамотрицательными бактериями, а с конкретными изучаемыми бактериальными организмами. То как меняется активность соединений при добавлении БСА показывает, что белковая нагрузка повышает реалистичность моделей in vitro. Подобная модификации позволяет хотя бы частично воспроизвести факторы, влияющие на антисептическую активность (специфические и неспецифические загрязнения, активность ферментов, локальное окружение и т.д. [21]). Такие испытания имеют особое значение, если вещество невозможно исследовать на моделях кожи человека (например, для агентов, находящихся на доклинических стадиях разработки).

Заключение

Нами было проведено сравнительное исследование антибактериальной активности двух производных ЧАС на основе пиридоксина в сравнении с хлоридом бензалкония в экспериментальных условиях на поверхности металла. Изучены бактерицидные свойства 0.1% и 0.2% водных растворов в отношении двух широко распространенных патогенов (S. aureus и E. coli). Анализ проводили на металлической поверхности, выдерживая растворы в течение 1, 5 и 15-ти минут. Для усложнения условий эксперимента дополнительно вводили белковую нагрузку (раствор БСА). Полученные данные показали, что соединение 1 проявило большую эффективность и по своему действию сопоставимо с препаратом сравнения (бензалкония хлоридом). Кроме того, для обоих изученных соединений наблюдался интересный эффект изменения специфичности в зависимости от времени воздействия. Данный эффект сохранялся даже в условиях усложнения эксперимента (введение нагрузки в виде БСА). Полученные результаты показали высокую активность исследуемых соединений (соответствуют критерию эффективности RF≥3). Кроме того, было наглядно продемонстрировано, что модель введения белкового загрязнения является полезным инструментом, способным повысить достоверность при исследовании эффективности антисептиков/дезинфектантов.

Источник финансирования

Исследование выполнено при финансовом обеспечении средств субсидии, выделенной Казанскому федеральному университету для выполнения государственного задания в сфере научной деятельности №FZSM- 2022-0018

Участие авторов

Все авторы внесли существенный вклад в проведение исследовательской работы и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию. Вклад авторов распределен следующим образом: М.Н. Агафонова, Е.Д. Кобылинская, Е.С. Булатова– выполнение исследования дезинфицирующей активности, вычислительный анализ. С.В. Сапожников, А.С. Биктимирова, Н.В. Штырлин – синтез, характеризация и очистка изучаемых соединений. Ю.Г. Штырлин – поисково-аналитическая работа. М.Н. Агафонова – написание статьи, направление рукописи на публикацию.

Конфликт интересов

Авторы данной статьи подтвердили отсутствие конфликта интересов, о котором необходимо сообщить.

Об авторах