Mechanisms of Cholera Agent Persistence under Varying Osmolarity Conditions

Full Text

Холера, вызываемая токсигенными штаммами Vibrio cholerae О1 серогруппы биовара Эль-Тор, в настоящее время является одной из самых распространенных водных инфекций в странах Южной Азии, Африки и Латинской Америки. Из эндемичных районов возбудитель постоянно завозится в различные страны мира, в том числе и в Российскую Федерацию, вызывая как вспышки, так и единичные случаи болезни, что указывает на неблагоприятный прогноз по холере на глобальном уровне и в России в частности [1, 2]. Несмотря на способность V. cholerae вызывать тяжелую болезнь с диарейным синдромом, человек не является обязательным звеном в жизненном цикле патогена. В настоящее время общепризнанно, что V. cholerae является аутохтонным обитателем открытых водоемов и, образуя ассоциации с фито- и зоопланктоном, долгое время сохраняется в них [3-7]. При этом идеальной средой обитания возбудителя холеры во внешней среде является солоноватая вода эстуариев [4, 8, 9]. В результате изучения экологии холерного вибриона установлен ряд физических, химических, биологических и климатических факторов (температура, pH, осмолярность, концентрация кислорода, наличие питательных веществ, высота поверхности моря, количество солнечных часов, осадков, присутствие бактериофагов и простейших, зоо- и фитопланктона и т. д.), оказывающих влияние на численность популяции V. cholerae в водной среде [6, 8, 10-15]. Среди них существенными признаны изменение температуры и осмолярности. Показано, что эпидемии холеры на эндемичной территории коррелируют с увеличением минерализации воды рек и эстуариев [9, 12-16]. Проблема сохранения V cholerae в условиях разной осмолярности актуальна и для Российской Федерации, принимая во внимание большое количество водоемов как с пресной, так и соленой водой, присутствующих на территории нашей страны, из которых выделяют токсигенные штаммы V. cholerae (при этом не только в период вспышек, но и в отсутствие эпидемических осложнений) [17]. Необходимо отметить, что при инфекционном процессе возбудитель холеры также подвергается воздействию разной осмолярности. Так, концентрация хлорида натрия в кишечном содержимом может достигать 0,3 М и выше [18], в то же время на поздней стадии инфекции (в стуле больного, имеющем вид рисового отвара) его концентрация составляет всего 0,14 М [9, 19]. Высказывается предположение, что изменение концентрации ионов натрия является одним из сигналов, вызывающих изменение экспрессии генов вирулентности при нахождении V cholerae в макроорганизме [9, 20, 21]. Учитывая, что как кишечный патоген и обитатель открытых водоемов возбудитель холеры в течение жизненного цикла постоянно подвергается воздействию осмотического стресса, в данном обзоре обобщены данные о механизмах адаптации токсигенных штаммов V. cholerae к условиям различной осмолярности, создаваемой хлоридом натрия. Влияние разных концентраций NaCl на выживаемость V. cholerae Холерный вибрион является галлофилом и для нормального роста ему необходима 2,0-2,5% (или 5-15 мМ) концентрация NaCl в среде выращивания [22, 23]. Однако при высокой температуре и присутствии в достаточном количестве питательных субстратов токсигенные штаммы V cholerae могут размножаться в средах как с низкой, так и с высокой концентрацией хлорида натрия [24]. Так, при температуре 4°C и 1% концентрации NaCl в воде штаммы V cholerae биовара Эль-Тор выживали до 45 дней, а при содержании NaCl 0,1-3% и температуре 25°c - до 72 дней [22]. При температуре 30°c (pH 8,5) и 15% концентрации хлорида натрия штаммы V. cholerae усиленно прикреплялись и размножались на копеподах (веслоногих ракообразных) [4, 15]. Холерные вибрионы могут расти в среде и без Nad, но в присутствии других солей натрия [8]. Кроме того, дефицит, а также избыток хлорида натрия компенсируются увеличением концентрации органических веществ, которые способствуют усиленному росту холерного вибриона. Так, присутствие органических веществ в пресной воде способствовало выживанию V. cholerae и при 45% концентрации Nad [8, 15, 22]. K.J. Pflughoeft и соавт. [25] экспериментально доказали, что штаммы V. cholerae, выращенные в условиях повышенного содержания хлорида натрия, в дальнейшем хорошо росли как в средах с низкой (5 мМ), так и с высокой (500 мМ) концентрацией Nad и в смешанной популяции вытесняли не адаптированные клоны. Авторы высказали предположение, что попадание солеадаптированных (например, находящихся в морской воде) штаммов V. cholerae в кишечник человека, имеющий высокую осмолярность, способствует их быстрому росту и размножению в отличие от штаммов, обитавших в пресных водоемах, у которых в данных условиях может быть осмотический шок и задержка роста. Кроме того, даже небольшое повышение осмолярности пресноводного водоема (например, в результате заброса морской воды) может вызывать резкий рост патогена и как следствие повышение вероятности заражения человека. Механизмы адаптации V. cholerae в условиях различной осмолярности Физиолого-биохимические механизмы устойчивости к осмотическому стрессу уже давно исследуются на таких модельных микроорганизмах, как Escherichia coli, Bacillus subtilis, Salmonella en- terica, Pseudomonas aeruginosa [26-29]. В результате выявлено, что осмотический стресс оказывает влияние на многие процессы клеточного метаболизма как грамположительных, так и грамотрица- тельных бактерий. При этом активность некоторых генов, индуцируемых изменением осмолярности среды, может иметь явную адаптивную функцию, в то же время экспрессия других генов не обнаруживает столь очевидной функции и, возможно, подготавливает клетки к воздействию других стрессовых факторов [30]. Наряду с механизмами, присущими отдельным видам, выявлены и общие, способствующие выживанию бактерий в условиях осмотического стресса, в том числе активация транспортных систем и биосинтез осмопротекторов (осмолитов или совместимых растворимых веществ). Указанные механизмы характерны и для возбудителя холеры [26, 30-34]. review В модельных экспериментах N.J. Shikuma и F.H. Yi1diz [9] установили, что даже небольшое увеличение концентрации Nad (с 0 до 0,5 М) приводит к изменению экспрессии 333 генов, большинство из которых вовлечены в метаболизм клеток V choler- ae, в процесс формирования клеточной оболочки, патогенез. Однако значительное количество генов (42,9 %) кодируют биосинтез белков с неустановленной функцией. При этом авторы выявили три группы генов - транскрипция первой группы активировалась в условиях повышенной концентрации Nad (0,5 М), второй - при средней (0,1-0,2 М), третьей - при низкой. При культивировании V. cholerae на средах с низким содержанием Nad выявлено увеличение транскрипции генов, кодирующих биосинтез компонентов клеточной стенки - мембраносвязанных олигосахаридов (MdoG, MdoH), а также полиаминов (SpeA, SpeB) [9]. Как известно, полиамины играют важную роль в процессах клеточного роста, регуляции синтеза ДНК, РНК и белка, стимулируя их транскрипцию и трансляцию [35]. В условиях низкой осмолярности среды мембраносвязанные олигосахариды также играют ключевую роль в сохранении структуры клеточной оболочки у P aeruginosa и регулируют объем периплазмы у E. coli [36, 37]. Вторая группа генов, активируемых при повышении концентрации хлорида натрия, включала структурные и регуляторные гены, необходимые для формирования биопленки. Иными словами, концентрация хлорида натрия модулирует прикрепление V. cholerae к поверхности и архитектуру биопленки [9]. Как известно, биопленка способствует выживанию патогена как во внешней среде, так и в макроорганизме (находящиеся в составе биопленки холерные вибрионы лучше защищены от уничтожения простейшими и более инфекциозны в отличие от свободноживущих изолятов) [4, 38, 39]. Следует отметить, что у E. coli в условиях изменения осмолярности важную роль в регулировании формирования биопленки играют белки двухкомпонентных систем cpxA- cpxR и EnvZ-ompR [40]. Однако у V. cholerae указанные системы не участвуют в данном процессе [9]. Выявлено, что наибольшая продукция двух основных факторов патогенности (холерного токсина и токсинкорегулируемых пилей адгезии) и регуляторных генов, контролирующих их экспрессию (tcpP, tcpH, toxT) также наблюдается при среднем (0,1-0,2 М) содержании Nad в среде выращивания, что соответствует условиям нахождения V. cholerae в кишечнике [9]. В условиях повышенной концентрации Nad в штаммах V. cholerae увеличивается биосинтез пигмента меланина, который одновременно защи- обзор щает клетки от повреждающего действия ультрафиолетовых лучей (солнечного света) [41]. Культивирование V. cholerae в условиях высокой концентрации хлорида натрия индуцировало биосинтез осмопротектора эктоина и Na+/H+- антипортера, про которые будет сказано ниже, а также белков-поринов внешней мембраны - OmpU/OmpT [9], что вполне естественно, учитывая их расположение на поверхности клетки. Содержание белка OmpU, выполняющего также адгезивную функцию и защищающего клетки от действия желчи и органических кислот, в зависимости от осмолярности среды может составлять 30-60% от количества всех белков внешней мембраны [42]. Необходимо отметить, что белкам внешней мембраны принадлежит ключевая роль в адаптации к изменению концентрации ионов натрия не только у возбудителя холеры, но и у других микроорганизмов. Осморегулируемыми белками являются OmpF и OmpC E. coli [43], OmpK35 и OmpK36 Klebsiella pneumoniae [44], OmpW и OmpV V. para- haemolyticus и V. alginolyticus [45, 46]. Увеличение экспрессии генов в ответ на повышение концентрации NaCl у возбудителя холеры связано с повышением биосинтеза альтернативных сигма-субъединиц РНК-полимеразы - rpoS (а38), rpoH (а32) и rpoN (а54) [47]. Данный факт является закономерным процессом, так как специфическое накопление альтернативных сигма-субъединиц обеспечивает своевременную транскрипцию набора генов, необходимых для выживания в условиях стресса, и является общим механизмом, позволяющим адаптироваться к стрессовым воздействиям различным протеобактериям [27, 48]. Например, у кишечной палочки продукция RpoS при стрессе (низкая температура, резкое изменение рН, высокая осмолярность) увеличивается в 3-20 раз [27]. При этом необходимо отметить, что у E. coli RpoS играет ключевую роль в устойчивости к высокой осмолярности среды, создаваемой как NaCl, так и KCl, LiCl и сахарозой [49]. Важная роль в регуляции содержания NaCl в цитоплазме бактерий в условиях повышенной осмо- лярности принадлежит различным транспортным системам (помпам), которые активно выводят ионы натрия наружу, поглощая ионы водорода или калия. Так, в удалении токсичных для клетки ионов Na+ (а также Li+) при их значительной концентрации в клетке в обмен на поступление Н+ участвует антипортерная система [9]. Антипортер холерного вибриона состоит из двух мембранных белков - NhaA и NhaB. Экспрессия гена nhaA (VC1627) позитивно контролируется белком-регулятором NhaR. Ген nhaB, расположенный в коровой части хромосомы, относится к группе генов «домашнего хозяйства» и незаменим в случае утраты гена nhaA [21, 24]. Белки антипортерной системы холерного вибриона гомологичны белкам других бактерий (V. parahaemolyticus, V alginolyticus, E. coli, S. enteriti- dis). Необходимо отметить, что №+/Н+-антипортер участвует также в создании №+-трансмембранного электрохимического потенциала, энергия которого используется для работы жгутика и транспорта веществ, а также регуляции внутриклеточного pH и объема клетки при нахождении бактерий в условиях щелочной реакции среды [24]. Быстро компенсируют осмотическое давление в клетках микроорганизмов за счет активного выведения ионов Na+ и поглощения из среды ионов K+, который в значительно меньшей степени связывает воду, чем ион натрия, такие системы как Kup, Trk и Kdp, выполняющие ключевую роль в поддержании внутриклеточной осмолярности, тургора клеток и pH цитоплазмы у кишечной палочки [50-52]. Необходимо отметить, что для поддержания внутриклеточной осмолярности и тургорного давления при осмотическом стрессе важна не столько концентрация ионов калия в клетках бактерий, столько соотношение Na+/K+ [47, 50, 51]. При внезапном повышении осмотического давления сначала активируется система Trk, обладающая низкой аффинностью к ионам калия и включающая четыре гена (trkE, A, G, H). Белок TrkE является АТФазой, Н^А участвует в связывании NAD+, два гомологичных белка TrkG и TrkH локализованы в мембране [34, 52, 53]. При этом у большинство штаммов E. coli, так же как и других бактерий, присутствует только один модуль (в основном TrkH). Далее, при продолжающемся стрессе (или дефиците K+) начинает экспрессироваться система Kdp, имеющая высокое сродство к калию и образующая комплекс из четырех белков (Kdp FABC). Белок KdpA участвует в формировании канала, KdpB является АТФазой, KdpC выполняет роль каталитического шаперона, а белок KdpF содержит трансмембранный домен и стабилизирует данный комплекс [34, 54]. Транспортная система Kup состоит из одного белка и не участвует в процессах осморегуляции при повышенной концентрации NaCl. Однако данная система индуцируется осмолярностью, создаваемой значительным содержанием сахаров, а также при резком снижении рН среды, т. е. в условиях, когда система Kdp не работает, а активность Trk резко снижена [55]. Роль рассмотренных выше транспортных систем в регуляции осмотического давления у возбудителя холеры до конца не изучена. Однако установлено, что в ответ на повышение концентрации ионов натрия увеличивается экспрессия гена trkH, что указывает на важную роль механизма выведения ионов Na+ и поглощения K+ в адаптации V cholerae в условиях высокой концентрации NaCl [47]. Одним из наиболее исследованных механизмов компенсации осмотического давления среды REVIEW О. (ЁсtB) © (ЁхЛА) нзС\_ n (Ectc) -H 4 7 ^NH„ 4-------------------------------- 7 /=° i © 7--^ © 7^ ^NH -Ц*- r^NH я У-NH, ( V e VnH, f > \ © > я L OOC L-glutamate g ^ 00C' Acetyl-CoA ^ ллл' ^ H2° OOC N CH3 glutarate OOC H L-аспартатр-полуальдегид 2,4-диаминобутират 1М-ацетил-2,4-диаминобутират Эктоин Рис. 1. Схема биосинтеза эктоина у бактерий [56]. у микроорганизмов является биосинтез осмопротекторов (осмолитов) - низкомолекулярных нейтральных веществ, синтезируемых самой клеткой или поглощаемых из окружающей среды. Осмолиты обладают высокой растворимостью, способны проникать через клеточную мембрану путем регулируемого транспорта и защищать ферменты от денатурации. К осмопротекторам относятся некоторые аминокислоты и их производные (глу- тамат, пролин, глицин-бетаин, эктоин), а также сахара (трегалоза, маннит, сахароза) [25, 34]. Необходимо отметить, что осмолиты в значительном количестве присутствуют в окружающей среде, так как их синтезируют de novo многие бактерии, растения и животные. Кроме того, некоторые клеточные компоненты (например, белки и липиды) могут гидролизоваться с образованием предшественников специфических осморегуляторов, таких как пролин и бетаин [30]. Считается, что у грамотрицательных бактерий при осмотическом стрессе удаление ионов Na+ и поглощение K+ является первичным ответом. При этом значительная концентрация калия в клетке может ингибировать активность некоторых ферментов, поэтому длительное нахождение клеток в условиях повышенной осмолярности или ее дальнейшее повышение служат триггером для вторичного ответа - биосинтеза осмолитов [51]. Так, поглощение ионов K+ наблюдается при росте V cholerae на средах с 200 мМ содержанием Nad, в то же время при повышении концентрации соли в среде выше 200 мМ в цитоплазме начинают накапливаться осмопротекторы [25]. X. Fu и соавт. [47] с помощью ПЦР в режиме реального времени показали, что в клетках V. cholerae, подвергшихся осмотическому стрессу (5% NaQ), повышается экспрессия генов, участвующих в биосинтезе глутамата. Полученные данные указывают, что продукция осмопротектора глута- мата является важным механизмом, способствующим выживанию возбудителя холеры в условиях высокого содержания хлорида натрия. В то же время экспрессия протон/глутамат-симпортера G1tP и натрий/глутамат-симпортера G1tS, участвующих соответственно в парном транспорте глутамата и H+/Na+ и активируемых у большинства бактерий параллельно с биосинтезом глутамата, у возбудителя холеры снижена. Данная стратегия согласуется с механизмом E. coli в ответ на осмотический стресс и указывает, что поглощение глутамата из внешней среды при осмотическом стрессе не является необходимым для данных микроорганизмов. Для синтеза осмопротектора эктоина (циклическая иминокислота) необходимо участие аспартокиназы и трех ферментов - EctB (L-2,4- диаминобутират трансаминаза, ЕС 2.6.1.76), EctA (2,4-диаминобутират ацетилтрансфераза, ЕС 2.3.1.178) и Ectc (эктоинсинтаза, Ес 4.2.1.108) (рис. 1) [56]. Путь биосинтеза эктоина достаточно консервативен в отношении ферментов и организации ect-оперона у разных бактерий. У возбудителя холеры гены, кодирующие данные ферменты, -------------------- Осмолярность _ Высокая _ I концентрация NaCl -. I i_ Подвижность V OscR | CosR VCA0822 ectC ectB ectA A Эктоин Рис. 2. Модель координированного изменения активности генов V cholerae регуляторами OsсR и OosR. Транскрипция cosR активируется при повышении концентрации хлорида натрия. Белок cosR репрессирует экспрессию генов, кодирующих транспортер осмопротекторов opuD, ферментов, участвующих в биосинтезе эктоина, а также подвижность, но активирует процесс формирования биопленки. Экспрессия oscR увеличивается при снижении осмолярности среды и содержании ионов натрия. oscR репрессирует формирование биопленки, снижая транскрипцию генов vps, ответственных за биосинтез экзополисахарида, но увеличивает подвижность [9, 58]. обзор расположены на малой хромосоме. Субстратом для биосинтеза эктоина является L-аспартат-Ь- полуальдегид, который в свою очередь синтезируется из глутамата [9, 25, 56]. Показано, что штаммы V. cholerae, имеющие делецию в гене ectA, не способны расти на средах с высокой осмолярно- стью. При этом эктоин синтезируется в условиях повышенной осмолярности среды, создаваемой как солями (NaCl, KCl), так и сахарами (лактоза), что указывает на зависимость экспрессии ectA от осмолярности среды, а не от содержания каких- либо специфичных ионов [9]. В то же время в геноме холерного вибриона не выявлено генов bet, ответственных за биосинтез глицин-бетаина. Однако большинство представителей рода Vibrio синтезируют данный осмопротектор из холина и экспрессируют его во внешнюю среду. При нахождении в составе биопленки в сообществе с другими бактериями штаммы V. cholerae способны поглощать глицин-бетаин, а также пролин из внешней среды. Показано, что присутствие глицин-бетаина во внешней среде при высокой концентрации NaCl не только усиливает рост V. cholerae, но и способность к формированию биопленки, что в итоге защищает бактериальную популяцию от осмотического стресса. Перенос глицин-бетаина и пролина из внешней среды в клетку у возбудителя холеры осуществляется соответственно при участии двух белков- транспортеров - OpuD и PutP [57]. Несмотря на важную роль осмопротекторов в выживании V. cholerae, механизм их продукции в ответ на повышение осмолярности среды до конца не изучен. Показана важная роль транскрипционного регулятора CosR (compatible solute regulator). Биосинтез белка CosR, относящегося к регуляторам типа Mar (multiple antibiotic resistance), кодируется геном cosR, расположенным на большой хромосоме, и увеличивается при повышении концентрации как NaCl, так и KCl. Образующийся белок CosR репрессирует транскрипцию генов, вовлеченных в биосинтез и транспорт осмопротекторов [58]. В условиях повышенной концентрации хлорида натрия CosR активирует процесс формирования биопленки, но ингибирует экспрессию генов, ответственных за подвижность, независимо от его функции в качестве регулятора эктоина (рис. 2). Высказывается предположение, что белок CosR играет важную роль в выживании возбудителя холеры как во внешней среде, так и в организме человека [58]. В условиях низкого содержания NaCl повышается активность другого регулятора - OscR (osmolarity controlled regulator), относящегося к семейству IclR (isocitrate lyase) - транскрипционных регуляторов, присутствующих у различных грамотрицательных и грамположительных бактерий [9, 58]. OscR оказывает положительное влияние на подвижность, но репрессирует формирование биопленки, подавляя транскрипцию генов vps, ответственных за продукцию экзополисахарида (см. рис. 2). Данный регулятор активирует и/или ингибирует биосинтез белков, содержащих GAF- домен, который связывается с ионами натрия и циклическими нуклеотидами [59]. Итак, в зависимости от концентрации хлорида натрия во внешней среде в клетках токсигенных штаммов V. cholerae координированно изменяется экспрессия различных генов при участии двух транскрипционных регуляторов - CosR и OscR. Таким образом, приведенные в обзоре данные показывают, что изменение осмолярности, создаваемой разной концентрацией хлорида натрия, наряду с другими факторами оказывает влияние на выживаемость возбудителя холеры и численность популяции при его нахождении как в макроорганизме, так и во внешней среде. При этом возбудитель холеры выработал механизмы, способствующие его устойчивости к условиям различной осмолярности. Возможно, в результате адаптации к солевому стрессу у штаммов V. cholerae появляются новые свойства и более высокая устойчивость к другим неблагоприятным воздействиям внешней среды. В связи с этим исследования влияния хлорида натрия на физиологию этого возбудителя необходимы для понимания механизмов его экологической устойчивости и возможности вызывать вспышки инфекции.

About the authors

Svetlana P. Zadnova

Russian Research Anti-Plague Institute «Microbe» of the Federal Service for Consumer Rights Protection and Human Welfare

Email: rusrapi@microbe.ru
MD, PhD, DSci., leading researcher of the Russian Research Anti-Plague Institute «Microbe» of the Federal Service for Consumer Rights Protection and Human Welfare 46, Universitetskaya str., Saratov, 410005, Russian Federation

N. A Plekhanov

Russian Research Anti-Plague Institute «Microbe» of the Federal Service for Consumer Rights Protection and Human Welfare

46, Universitetskaya str., Saratov, 410005, Russian Federation

N. I Smirnova

Russian Research Anti-Plague Institute «Microbe» of the Federal Service for Consumer Rights Protection and Human Welfare

Email: rusrapi@microbe.ru
46, Universitetskaya str., Saratov, 410005, Russian Federation

References

Supplementary files