СЕРОТИПИРОВАНИЕ ШТАММОВ STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE, ВЫДЕЛЕННЫХ У ДЕТЕЙ НА СРЕДНЕМ УРАЛЕ, МЕТОДОМ МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ ПЦР

Полный текст

Streptococcus pneumoniae является одним из основных возбудителей как инвазивных (менингит, сепсис), так и неинвазивных (средний отит, синусит и др.) форм острых и хронических инфекционновоспалительных заболеваний легких (ХИВЗЛ) у детей и взрослых [5, 11]. По данным разных авторов, распространенность инвазивных форм пневмококковых инфекций находиться в пределах 15-30 на 100 000 населения, но частота существенно варьирует в различных возрастных группах [15, 20, 25, 27]. Исходя из антигенных свойств полисахаридной капсулы, выделяют 46 серогрупп и 91 серотип пневмококка. По мнению ряда авторов, спектр преобладающих серотипов зависит от возраста, временшго фактора и географического региона, хотя наиболее часто встречающиеся типы капсул идентифицированы повсеместно [2, 6, 10, 11]. В настоящее время одним из основных способов, влияющих на заболеваемость пневмококковой инфекцией, является вакцинопрофилактика. К пневмококковым вакцинам относят конъюгированные: 7-валентную, 10-валентную, 11-валентную и 13-валентную и 23-валентную полисахаридную вакцину [6, 16, 19]. Конъюгированные вакцины (PCV, pneumococcal conjugate vaccine) различаются между собой числом серотипов пневмококка, входящих в их состав. В PCV7 включены серотипы 4, 6B, 9V, 14, 18С, 19F и 23F, в PCV10, помимо вышеперечисленных, входят дополнительно серотипы 1, 5 и 7F, в PCV11 - серотип 3, в PCV13 - серотипы пневмококков 3, 6А и 19А. Полисахаридная пневмококковая вакцина содержит максимальное количество очищенных капсульных полисахаридов S. pneumoniae - 23 серотипа: 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19F, 19A, 20, 22F, 23F, 33F [14, 23]. Для корреспонденции: Саматова Елена Валерьевна, врач-бактериолог лаб. клинической микробиологии ОДКБ №1, заочный аспирант каф. клинической лабораторной диагностики и бактериологии фак. повышения квалификации и профессиональной переподготовки УГМА, e-mail: lavrinenko@eka-net.ru 26 Для оценки эффективности пневмококковых вакцин необходимо принимать во внимание, какие се-ротипы S. pneumoniae циркулируют на данной территории. В проведенных ранее немногочисленных исследованиях было показано, что в России у детей в возрасте до 5 лет доминируют серотипы 19, 6, 23, 14, 3, 9, в меньшей степени - 18 и 7. Распространенность серотипов пневмококка, вызывающих инфекции в разных возрастных категориях, в доступной отечественной литературе не описаны [3, 4, 6, 8, 9, 11]. Серотипирование пневмококков также необходимо для изучения этиологии обострений ХИВЗЛ, их лечения и профилактики. Цель исследования - определение состава серо-типов S. pneumoniae, выделенных на территории Среднего Урала, в том числе у детей с хроническими инфекционно-воспалительными заболеваниями легких. Материалы и методы В исследование были включены дети в возрасте от 5 мес до 17 лет с инвазивными заболеваниями - 4 (менингит, сепсис), внебольничной пневмонией - 7, ХИВЗЛ - 34 (бронхоэктатическая болезнь, хронический бронхит), острым средним отитом (ОСО) - 5, риносинуситом - 42 и дети без признаков тонзиллита, обследованные на носительство пневмококка, -77, проживающие в Екатеринбурге и Свердловской области (Нижнем тагиле, Каменск-Уральский, Асбесте). У детей проводился посев следующих клинических материалов: при инвазивных заболеваниях -кровь, спинно-мозговая жидкость (СМЖ); при вне-больничной пневмонии - мокрота, плевральный выпот, бронхоальвеолярный лаваж (БАЛ); при ХИВЗЛ - БАЛ, мокрота; при ОСО - отделяемое среднего уха; при риносинусите - отделяемое из полости носа; на носительство пневмококка - мазок со слизистой зева. С января 2005 г. по февраль 2012 г. было выделено 129 штаммов S. pneumoniae. Доставку и исследование клинических материа лов проводили согласно МУ 4.2.2039-05 «техника сбора и транспортирования биоматериалов в микробиологические лаборатории» и приказу от 22.04.85 Минздрава СССР № 535 [12, 18]. Методика посева и набор питательных сред определялись видом исследуемого клинического материала. Идентификация и реидентификация выделенных штаммов S. pneumoniae осуществлялись на основании: морфологии колоний на кровяно-сывороточном агаре (КСА, заявка на патент от 08.07.11, регистрационный № 2011128466) после инкубации в обычной атмосфере при температуре 37°С в течение 18-24 ч, наличия α-гемолиза, чувствительности к оптохину, характеру роста в сахарном и сахарно-сывороточном бульонах, каталазной реакции, положительных результатов латекс-агглютинации с использованием набора Slidex pneumo-Kit (“bioMerieux”, Франция). Выделенные штаммы пневмококков хранили в пробирках с триптиказо-солевым бульоном с добавлением 15% стерильного глицерина при -70С и параллельно способом для длительного хранения бактерий в авторской модификации при -20С. За 6 мес до определения серотипов замороженные штаммы после извлечения из холодильника засевали на КСА, инкубировали в течение суток в атмосфере с повышенным содержанием CO2 (5%) при 37°С, затем 4-5 полных бактериологических петель (диаметром 1 мм) полученной субкультуры инокулировали в 250 мкл транспортной среды (физиологический раствор с добавлением 0,1% азида Na) и немедленно замораживали при -20С, где и хранили их до использования. Определение серологических типов S. pneumoniae осуществлялось методом мультиплексной ПЦР. Праймеры («Syntol», Россия), специфичные для различных генов S. pneumoniae, синтезированы на основании нуклеотидных последовательностей, приведенных в статье D.A. Brito и соавт. [19], где также подробно описана методика молекулярного типиро-вания пневмококков, поэтому нами кратко приведены суть технологии и ее модификации. ПЦР-смесь в объеме 25 мкл включала дезоксинуклеотидтрифос-фаты («Fermentas», Германия) в конечной концентрации 0,1 мЫ, прямой и обратный праймеры 0,3 пЫ, сульфат магния (ЦНИИЭ, Россия) 3,5 hM, химически инактивированную TaqF ДНК-полимеразу (ЦНИИЭ, Россия) - 2 ЕД, деионизованную воду в объеме, необходимом для достижения 22,5 мкл. Исследуемый материал в виде бактериальной суспензии в транспортной среде вносился в объеме 2,5 мкл. ПЦР проводилась в амплификаторе терцик («ДНК-технология», Россия) при следующих условиях: 15 мин при 95°С, 30 циклов; 10 с при 95°С; 15 с при 60°С; 15 с при 72С; 5 мин при 72С. Детекция результатов ПЦР осуществлялась с помощью электрофореза. 10 мкл ПЦР -продукта вносили в 2% агарозный гель, окрашенный бромистым этидием. В каждую серию ставили маркер молекулярной массы размером 100 пар нуклеотидов (п. н) («СибЭнзим», Россия). Параметры электрофореза были следующими: напряжение 180 В, сила тока 160 мА, мощность 30 Вт. Вре мя проведения электрофореза зависело от размеров ожидаемых ПЦР-продуктов: при размере продуктов менее 818 п. н. 45 мин, при размере 980-1187 п. н. электрофорез проводился 80 мин. Документирование результатов электрофореза и интерпретация результатов проводились с использованием системы Gel DocXR («Bio-Rad», США) в программе Quantity One («Bio-Rad», США). Все образцы были распределены на группы в соответствии с результатами группоспецифических реакций. При одновременной наработке низкомолекулярных и высокомолекулярных ПЦР-продуктов (например, продукт A размером 1187 п. н., продукт В - 980 п. н.) наблюдалось конкурентное ингибирование синтеза последних, что привело к появлению ложнопозитивных результатов, приведших к расширению 1-й группы за счет 2-й и 3-й групп, а также 6-й группы за счет 4-й и 5-й групп. такие образцы были дополнительно протестированы при модифицированных условиях ПЦР: увеличение количества циклов до 35 с увеличенным временем присоединения праймеров и элонгации (до 20 и 30 с соответственно), а также в условиях отсутствия праймеров для синтеза низкомолекулярных продуктов. Это дало возможность получить распределение между группами, сопоставимое с ранее опубликованными данными [6, 9, 10, 18, 19, 24]. Далее внутри каждой группы проводились серотипоспецифические реакции, позволяющие определить серотип S. pneumoniae. Кроме того, для исключения случайной ошибки образцы, попавшие в 1-ю группу, были протестированы в серотипоспецифических реакциях для 2-й и 3-й групп, а образцы, включенные в 6-ю группу, - в серотипоспецифических реакциях для 4-й и 5-й групп. При этом ни в одном случае неспецифических продуктов ПЦР получено не было. Последовательно проведенные мультиплексные ПЦР в описанном нами варианте позволяют определить отдельные серотипы или неделимые совокупности се-ротипов, приведенные в таблице [19]. Результаты и обсуждение Из 129 штаммов S. pneumoniae, протестированных методом мультиплексной ПЦР, серотип определен у 91,5% штаммов (см. таблицу). По данным литературы, количество нетипируемых штаммов, определяемых молекулярными методами, варьирует от 0,7 до 15% [6, 9, 10, 19]. Как видно из данных, представленных в таблице, первенство было разделено между серотипами 6A/6B, 23F, 19F и неделимой совокупностью - 8, 9VA, 11FABCD, 12F, 15A, 33F (в сумме 58,1%). Дети первых лет жизни являются основными источниками пневмококковой инфекции, заражая окружающих, в том числе и взрослых [11]. Поэтому интерес представляет также распределение серотипов пневмококка в разных возрастных группах пациентов: дошкольников (0-6 лет, n = 66) и школьников (7-17 лет, n = 63), что показано на рисунке (n - количество детей с учетом обследованных в динамике). 27 ЭПИДЕМИОЛОГИЯ И ИНФЕКЦИОННЫЕ БОЛЕЗНИ, № 5, 2012 Результаты серотипирования пневмококков у детей по нозологиям Количество Вид заболевания и клинический материал Серотип штаммов (абс.% от общего) сепсис, менингит: кровь, СМЖ внебольничная пневмония: мокрота, плевральный выпот, БАЛ ХИВЗЛ: БАЛ, мокрота ОСО: отделяемое из среднего уха риносинусит: отделяемое из полости носа носители: мазок со слизистой зева 3 13/10 1 0 1 0 7 4 5, 10А 2/1,6 1 0 0 0 1 0 20 2/1,6 0 0 1 0 0 1 19А 4/3,2 1 0 1 0 1 1 8, 9V, 9A, 11F, 11A, 11B, 11C, 11D, 12F, 15A, 33F 15/11,5 1 1 7 1 3 2 4 0/0 0 0 0 0 0 0 14 2/1,6 0 0 0 0 1 1 9L, 9N, 15B, 15C 2/1,6 0 0 0 0 2 0 6A, 6B 27/20,8 0 1 14 1 10 1 18F 2/1,6 0 0 1 0 1 0 23F 18/13,9 0 1 11 0 4 2 2, 15F, 17F, 22F, 23B 5/3,9 0 0 1 1 3 0 1 0/0 0 0 0 0 0 0 18B, 18C 5/3,9 0 0 5 0 0 0 19F 15/11,5 0 2 9 1 3 0 7F, 19B, 19C, 23A 4/3,2 0 0 1 1 2 0 18A 2/1,6 0 0 2 0 0 0 ПЦР отрицательна, продукт амплификации cpsА отсутствует 11/8,5 0 2 2 0 4 3 Всего штаммов (абс.% от общего) 129/100 4/3,1 7/5,4 56/43,4 5/3,8 42/32,6 15/11,7 Выявлены достоверные различия в частоте обнаружения серотипов 3, 19F и нетипируемых штаммов S. pneumoniae между детьми дошкольного и школьного возраста. Наиболее вирулентные сероти-пы - 3, 5, 14 также преимущественно встречались у дошкольников. К сожалению, небольшая частота выделения пневмококков не позволила выявить достоверные различия внутри следующих возрастных категории: до 1 года, 1-3 года, 4-6 лет, 7-10 лет, 1114 лет и 15-17 лет. Известно, что на долю серотипов 19, 23, 14, 6, 18, 9, 4 в США приходится свыше 80% от числа всех инвазивных инфекций среди детей до 5 лет, а в России преобладают серотипы 19, 23, 1, 14, 3 и 5 [6, 7, 10, 21, 22]. При инвазивных инфекциях мы обнаружили следующие серотипы: 3, 19А и неделимые совокупности 5, 10А и 8, 9V, 9A, 11F, 11A, 11B, 11C, 11D, 12F, 15A, 33F (по 25%). В общей сложности от 34 детей с ХИВЗЛ выделено 56 штаммов S. pneumoniae, относящихся к 12 серотипам. При этом 15 детей были обследованы в динамике, из них у 11 детей пневмококк выделялся двукратно, у 1 ребенка - троекратно, у 3 - четырехкратно. Превалировали 6A/6B (25%); 23F (19,6%); 19F (16%) и неделимая совокупность серотипов - 8, 9 V, 9A, 11F, 11A, 11B, 11C, 11D, 12F, 15A, 33F (12,5%). Общая доля наиболее часто встречаемых серотипов составила 73,2%. Серотип 3 выявлен лишь в 1,8% случаев. На оставшиеся 26,8% пришлись серотипы: 18F, 19F, 18A и неделимые совокупности: 18B, 18C; 7F, 19B, 19C, 23A и 2, 15F, 17F, 22F, 23B. Известно, что достоверным доказательством этиологии обострения хронических бронхолегочных заболеваний являются пневмококки, выделенные из «истинной» мокроты и БАЛ [1], поэтому наши данные лишь условно можно сравнить с результатами, полученными в исследованиях Н.А. Маянского и соавт. [9]. Авторы приводят данные о серотипах S. pneumoniae, выделенных из ларинготрахеального аспирата детей с муковисцидозом и синдромом Кар-тагенера. При этом наиболее часто встречаемыми серотипами были: 19 (19А+19F; 20%), 23F (16%), 6А/6В и 9V (по 12% каждый), серотип 3 в этой группе больных выявлен не был. Л.К. Катосова и соавт. [3] изучали серотипы пневмококка, выделенные из мокроты, промывных вод бронхов детей с хронической пневмонией, рецидивирующим бронхитом, муковисцидозом. Наиболее часто они обнаруживали серогруппы/серотипы: 6 (21,9%), 19 (20,5%), 3 (11%), 42 (6,8%); 23 и 9 встречались редко - в 1,4 и 2,7% случаев соответственно. В нашем исследовании у детей с внебольничной пневмонией были выявлены серотипы, практически идентичные серотипам, выделенным при ХИВЗЛ: 28 Ц Дошкольники [§Ц Школьники Серотонины S. pneumoniae, выделенные у детей разных возрастных групп. НТ - нетипируемые штаммы;p < 0,05. 19F (28,6%); 23F (14,2%); 6А/6В (14,2%), а также неделимая совокупность серотипов - 8, 9У, 9А, Hf, 11а, 11В, 11С, 11D, 12F, 15А, 33F (14,2%). Из источников литературы известно, что этиология большинства пневмоний связана с серотипа-ми 1-4, 6-8, 14, 18, 19 [4, 8, 9, 17]. Так, по данным Л.К. Катосовой и соавт. [4], 62,3% штаммов пневмококка, выделенных у детей с пневмонией и плевритом, относились к 5 типам/группам: 1, 6, 19, 14 и 3. По данным Р.С. Козлова и соавт. [6], к наиболее часто встречаемым серотипам относились 19 (33,6%), 6 (15,8%), 23 (8,9%) и 14 (7,2%). Следовательно, приведенные нами данные в сравнении с исследованиями, проведенными в 90-е годы [4, 17], показывают, что на современном этапе в серотиповом спектре S. pneumoniae у детей с острыми и хроническими бронхолегочными заболеваниями преобладают серотипы 6А/6В, 23F, 19F при снижении доли 3 и 42. У детей с диагнозом риносинусита, первенство разделено между серотипами 6А/6В и 3 (в сумме 40,5%). К особенностям можно отнести присутствие неделимой совокупности серотипов 5, 10А, которая не встречалась у носителей и детей с ХИВЗЛ. У 8 детей с диагнозом риносинусит, кроме посева, отделяемого из полости носа, делался посев со слизистой зева, где также выделен пневмококк. В результате у 6 детей серотипы S. pneumoniae, выделенные из зева и носа, были различны, лишь у 1 ребенка они совпали. Занятен тот факт, что еще у 1 ребенка с диагнозом риносинусита из зева выделены 2 штамма пневмококка и 1 штамм из носа, которые отличались: морфологией колоний на КСА (точечные; блюдцеобразные водянистые, блюдцеобразные, все с α-гемолизом), зонами подавления роста вокруг диска с оптохином (d = 27, 35, 30 мм соответственно), а также чувствительностью к различным классам антибиотиков. При этом 1 штамм пневмококка со слизистой зева совпал по серотипу со штаммом из полости носа - 6А/6В, а 2-й штамм из зева относился к серотипу 3. Даже в пределах одной семьи серо-типы S. pneumoniae могут различаться, что, вероятно, связано с возрастом пациентов. Так, у сестер 2 и 4 лет из отделяемого полости носа при рино-синусите нами были выявлены различные неделимые совокупности се-ротипов: 8, 9У, 9А, 11F, 11А, 11В, 11С, 11D, 12F, 15А, 33F и 5, 10А. В свою очередь при ОСО выявлены серотипы 6А/6В, 19F и неделимые совокупности: 2, 15F, 17F, 22F, 23В и 8, 9У, 9А, 11F, 11А, 11В, 11С, 11D, 12F, 15А, 33F (по 20% соответственно). В целом наши данные не противоречат полученным ранее результатам сероти-пирования в РФ и США, где при ОСО превалируют серотипы 19, 6, 23, 14, 3 и 18 [6, 10, 13]. Среди бактерионосителей выделено всего 7 серотипов: наиболее часто выявлялся серотип 3 (26,6%), а также 23F (13,4%), 20 (6,7%), 19А (6,7%), 14 (6,7%), 6А/В (6,7%) и неделимая совокупность серотипов: 8, 9У, 9А, 11F, 11А, 11В, 11С, 11D, 12F, 15А, 33F (13,4%). Интересным является факт, что не обнаружен ни один серотип, который встречался бы только у бактерионосителей. Это, вероятно, можно объяснить тем, что инвазивные и неинвазивные пневмококковые инфекции часто носят эндогенный характер. Так как пневмококковые вакцины являются частью программы плановой иммунизации детей, поддерживаемой многими странами, необходимо проводить иммунизацию с учетом результатов серотипи-рования S. pneumoniae на конкретных территориях [11, 20, 22]. При сопоставлении серотипов, входящих в состав конъюгированных пневмококковых вакцин, с серотипами S. pneumoniae, выделенных от детей с ХИВЗЛ, выявлено совпадение серотипового спектра на 96,3% с 7-валентной, 98,2% с 10-валентной, 100% с 11-валентной и с 13-валентной вакцинами. При сравнении полученных данных с результатами исследования, проведенного Р.С. Козловым и соавт. по РФ [6], выявлено, что у детей в Уральском регионе также доминируют серотипы 6А, 6В, 23F, 19F, но в меньшей степени - 3 и 14. Серотипы пневмококка 6А, 6В обнаружены наиболее часто у детей всех возрастов. Таким образом, у детей с острыми и хроническими бронхолегочными заболеваниями преобладают следующие серотипы S. pneumoniae: 6А, 6В, 23F, 19F, входящие в состав всех конъюгированных пневмококковых вакцин. В то время как менингит и сепсис вызваны чаще серотипами 19А и 3, которые оба включены лишь в 13-валентную пневмококковую 29 ЭПИДЕМИОЛОГИЯ И ИНФЕКЦИОННЫЕ БОЛЕЗНИ, № 5, 2012 вакцину. Наиболее вирулентный серотип 3 преимущественно встречается у детей до 6 лет, а серотип 19F - старше 6 лет. Авторы выражают благодарность врачам-бактериологам за помощь в сборе образцов: ГБУЗ СО ОДКБ № 1, Екатеринбург - Кукушкиной М.П., Блиновой С.М., Устюговой С.С.; МАУ ГКБ № 40, Екатеринбург - Паниной Е.Ю.; МБУ ДГКБ № 11 Екатеринбург - Кочневой Н.А.; МУЗ ДГБ № 1, Нижний Тагил - Водовоз Н.Ю.; ГБУЗ СО ГБ № 7 Каменск-Уральск - Муруновой Н.В.; ГБУЗ СО ДГБ город Асбест - Груздеву А.И.

Об авторах

Е. В Саматова

ГБОУ ВПО Уральская государственная медицинская академия Минздравсоцразвития России

Email: lavrinenko@eka-net.ru
врач-бактериолог лаб. клинической микробиологии ОДКБ №1, заочный аспирант каф. клинической лабораторной диагностики и бактериологии фак. повышения квалификации и профессиональной переподготовки УГМА 620028, Екатеринбург,ул. Репина, 3

А. Е Друй

ГБОУ ВПО Уральская государственная медицинская академия Минздравсоцразвития России

Email: Dr-Drui@yandex.ru
очный аспирант каф. клин. лаб. диагностики и бактериологии УГМА, врач клин. лаб. диагностики лаб. молекулярной биологии Центра детской онкологии и гематологии ОДКБ № 1, мл. науч. сотр. лаб. клеточной терапии онкогематологических заболеваний ИМКТ 620028, Екатеринбург,ул. Репина, 3

Г. А Цаур

ГБУЗ СО Областная детская клиническая больница № 1

Email: tsaur@mail.ru
канд. мед. наук, зав. лаб. молекулярной биологии Центра детской онкологии и гематологии ОДКБ№ , вед. науч. сотр. лаб. клеточной терапии онкогематологических заболеваний ИМКТ 620149, Екатеринбург, ул. Серафимы Дерябиной, 32

Л. Г Боронина

ГБОУ ВПО Уральская государственная медицинская академия Минздравсоцразвития России

Email: boroninalg@mail.ru
д-р мед. наук, проф. каф. клин. лаб. диагностики и бактериологии УГМА , зав. лаб. клин. микробиологии ОДКБ №1 620028, Екатеринбург,ул. Репина, 3

Список литературы

Дополнительные файлы