Доклиническое исследование токсикологического профиля нового соединения XC221GI

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ

Вспышка новой коронавирусной инфекции (COVID-19) в 2019 году стремительно приобрела статус важной медицинской проблемы, и уже в марте 2020 года была объявлена Всемирной организацией здравоохранения чрезвычайной ситуацией международного значения [1]. Особенностью COVID-19 является интенсивное вирусиндуцированное воспаление в жизненно важных структурах организма и пространственно-временная дисрегуляция синтеза про-/противовоспалительных цитокинов и хемокинов, что выражается в непредсказуемости клинического течения и высоком риске формирования «цитокинового шторма». Состояние «цитокинового шторма» является патогенетической основой развития таких грозных осложнений, как тромбоэмболические события [2], острый респираторный дистресс-синдром [3], полиорганная недостаточность [4]. В результате ряда исследований установлено, что клинические проявления и инструментальные признаки вирусной пневмонии могут развиваться уже через 24–72 ч от начала репликации вируса в респираторном тракте [5].

В этой ситуации актуальной задачей практического здравоохранения является подбор эффективных и безопасных схем терапии, позволяющих управлять вирусиндуцированным воспалением в рамках упреждающей противовоспалительной терапии.

В настоящей работе представлена токсикологическая характеристика оригинального низкомолекулярного соединения ХС221GI (1-[2-(1-метилимидазол-4-ил)-этил]пергидроазин-2,6-дион) по результатам доклинических исследований. Соединение ХС221GI (разработчик ООО «Фарминтерпрайсез») активно изучалось с 2014 года в качестве противовоспалительного и противовирусного средства для лечения и профилактики заболеваний, вызываемых респираторными вирусами (респираторно-синцитиальный вирус, вирус гриппа, риновирус, SARS-CoV-1 и др.). Полученные результаты характеризуют уникальный фармакодинамический профиль ХС221GI, выражающийся в возможности управления уровнем продукции ключевых маркеров воспаления ИЛ-6, ИЛ-8 и CXCL10. В связи с этим у разработчиков было достаточно оснований полагать, что XC221GI проявит благоприятный профиль польза/риск при лечении пациентов с COVID-19, что и было подтверждено в последующих клинических исследованиях.

Цели исследования ― оценка токсикологического профиля соединения XC221GI при однократном и многократном введении; изучение генотоксичности, канцерогенного потенциала, репродуктивной токсичности, аллергизирующего действия и иммунотоксичности.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследования на животных выполняли с соблюдением принципов надлежащей лабораторной практики (Good laboratory practice, GLP; ГОСТ 33044-2014 «Принципы надлежащей лабораторной практики»¹, Приказ Минздрава России от 01.04.2016 N 199н «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики»²), а также других рекомендаций по содержанию и использованию животных [6]. Лабораторных животных получали из питомников ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий» Федерального медико-биологического агентства России, питомника Charles River (Германия) или исследовательской организации MediTox s.r.o. (Чехия).

Этическое утверждение

Авторы подтверждают соблюдение институциональных и национальных стандартов по использованию лабораторных животных в соответствии с согласованными авторскими рекомендациями (IAVES, 23.07.2010³). Протоколы исследований одобрены соответствующими комиссиями по биоэтике (заключения №№ 3/2016-1, 6/2016-1, 2/2017-1, 3/2016-3, 18/2016-2, 26/2016-1, 5-2016_1, 16/2016-1, 12/2016-2, 12/2016-4, 6/2016-2, 12/2016-3, 73/2018).

Статистический анализ

Статистический анализ проводили с помощью программы Graph PadPrism (версия 5) и с использованием программного пакета Statistica v. 7. Для показателей рассчитывали медианы, средние арифметические значения, стандартные ошибки средних арифметических значений и стандартные отклонения. Данные для самцов и самок анализировали отдельно. Для межгрупповых сравнений в экспериментах использовали тест Крускала−Уоллиса с пост-тестом Данна (при малом количестве наблюдений) или однофакторный дисперсионный анализ с пост-тестом Даннета (после подтверждения нормального характера распределения по критерию Колмогорова–Смирнова и однородности дисперсии по критерию Бартлетта или F-критерию). При попарных сравнениях применяли t-критерий (при нормальном распределении) или критерий Манна−Уитни (при распределении, отличающемся от нормального). Различия считали статистически значимыми при p <0,05.

Изучение токсичности при однократном введении

Использовали аутбредных (нелинейных) лабораторных мышей обоих полов (масса тела самцов 21–25 г, масса тела самок 20–24 г) и аутбредных крыс обоих полов (масса тела самцов 195–205 г, масса тела самок 190–205 г). Фармацевтическую субстанцию применяли в форме раствора; в качестве носителя использовали 1% раствор полисорбата-80 в дистиллированной воде. Мышам (n=6 каждого пола в группе) однократно внутрижелудочно вводили XC221GI в дозе 5000 мг/кг или носитель. Крысы в эксперименте с внутрижелудочным дозированием (n=4 каждого пола в группе) получали однократно XC221GI в дозе 5000 мг/кг (максимальная доза, которую технически можно было ввести мышам или крысам) или носитель. До введения исследуемого соединения оценивали массу тела животных, в течение 60 мин после дозирования наблюдали за состоянием особей: оценивали признаки угнетения или возбуждения центральной нервной системы, судороги, тремор, признаки изменения активности вегетативной нервной системы. На протяжении дня после дозирования оценивали смертность. За выжившими животными наблюдали в течение 14 дней после введения XC221GI; осмотр выполняли 2 раза в день. По завершении наблюдения всех выживших животных умерщвляли путём ингаляции диоксида углерода с последующим обескровливанием.

Изучение токсичности при многократном введении

В исследовании по подбору доз все животные получали исследуемое соединение внутрижелудочно. Во всех экспериментах половину животных умерщвляли на следующий день после завершения дозирования, оставшихся особей ― на следующий день по окончании периода наблюдения. Массу тела измеряли еженедельно. Электрокардиографию (ЭКГ) с помощью электрокардиографа «Поли-Спектр-8/В» (ООО «Нейрософт, Россия), измерение артериального давления (АД) неинвазивным методом (MK-2000ST NP-NIBP Monitor, Muromachi Kikai CO, Ltd., Япония) и подсчёт частоты дыхательных движений (ЧДД) выполняли после 14 дней дозирования и по завершении восстановительного периода. Спонтанную двигательную активность крыс в тесте «открытое поле» оценивали на 15-й и 30-й дни в прямоугольной камере [7]. На 15-й и 30-й дни отбирали также образцы крови для клинического и биохимического анализа, собирали образцы мочи для общего анализа. При клиническом анализе крови оценивали количество эритроцитов, средний объём эритроцита, уровень гемоглобина, гематокрит, среднее содержание гемоглобина в клетке, среднюю концентрацию гемоглобина на клетку, количество лейкоцитов, лейкоцитарную формулу, количество тромбоцитов при помощи автоматического анализатора (BC-2800Vet, Китай). Биохимический анализ крови выполняли при помощи диагностических наборов (Ольвекс диагностикум, Россия), уровень глюкозы оценивали с использованием глюкометра (One touch Select, Швейцария), оптическую плотность измеряли с помощью фотометра (iMark, Bio-Rad, США); параметры биохимического анализа крови включали активность аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (АСТ) и щелочной фосфатазы, уровень креатинина, мочевины, триглицеридов, глюкозы, общего белка, альбуминов, глобулинов, холестерина и соотношение альбуминов и глобулинов. В общем анализе мочи (анализатор Doc UReader, Венгрия) оценивали удельную массу, pH, содержание билирубина, кетоновых тел, глюкозы, белка, эритроцитов и лейкоцитов.

Крыс или кроликов умерщвляли путём ингаляции диоксида углерода с последующим обескровливанием. Во всех экспериментах при патоморфологическом исследовании оценивали проявления раздражающего действия исследуемой субстанции или готовой лекарственной формы на слизистую оболочку желудка.

Двухнедельное исследование токсичности на крысах. Использовали самцов (масса тела 220–250 г) и самок (масса тела 200–220 г) аутбредных крыс. По 12 особей каждого пола распределяли для внутрижелудочного введения XC221GI в дозе 17,4; 87 или 174 мг/кг в сутки или носителя в течение 14 дней; выбранные дозы исследуемого соединения соответствовали эквиваленту терапевтической дозы (ТД), 5 ТД или 10 ТД для человека. Дважды в день проводили осмотр животных для регистрации смертности и оценки признаков токсичности, изменения поведения и общего состояния. После умерщвления крыс выполняли патоморфологическое исследование с оценкой массы и гистологической структуры внутренних органов.

Исследование токсичности с тридцатидневным дозированием на крысах. Использовали аутбредных крыс (масса тела самцов 230–260 г, масса тела самок 200–230 г). Методология исследования, изученные дозы XC221GI, количество животных в группах и распределение по полу соответствовали дизайну, использованному для двухнедельного эксперимента. Длительность дозирования составляла 30 дней, продолжительность восстановительного периода ― 30 дней.

Исследование токсичности с трёхмесячным дозированием на крысах. Использовали аутбредных крыс обоих полов (масса тела самцов 220–260 г, масса тела самок 210–250 г). Дизайн эксперимента был идентичен методам эксперимента с введением соединения в течение месяца, за исключением длительности дозирования (90 дней). Продолжительность восстановительного периода составила 30 дней. Оценку АД, показателей ЭКГ, ЧДД, тест «открытое поле», отбор образцов крови и мочи для анализов выполняли на 91-й день от начала дозирования и на 31-й день восстановительного периода.

Исследование токсичности на кроликах. Исследования проводили на кроликах породы Советская шиншилла обоих полов (масса тела 2,25–3,3 кг). Дизайн исследований на кроликах соответствовал методологии, использованной для исследований на крысах, описанной выше, за исключением оценки поведения и двигательной активности, которую проводили в ходе клинического осмотра без применения специальных методик. В группах из 12 самцов и самок животные получали внутрижелудочно XC221GI в дозе 9,1; 45,5 или 91 мг/кг в сутки (ТД, 5 ТД и 10 ТД соответственно). Кроликам из контрольной группы (12 самцов и самок) вводили носитель. Проведены три серии экспериментов, в которых XC221GI вводили в течение разных периодов времени: 14 дней; 28 дней с восстановительным периодом 28 дней; 3 мес с восстановительным периодом 30 дней.

Исследование с четырёхнедельным дозированием на собаках. Собаки обоих полов (n=32, возраст 6–8,5 мес, масса тела самцов 8,4–14,4 кг, масса тела самок 7,6–13,3 кг) получали XC221GI перорально в форме твёрдых желатиновых капсул в дозе 6 (3 самки и 3 самца), 30 (3 самки и 3 самца) или 60 мг/кг в сутки (5 самок и 5 самцов) в течение 28 сут, что соответствовало ТД, 5 ТД и 10 ТД для человека. Животные из контрольной группы (5 самок и 5 самцов) получали твёрдые желатиновые капсулы без действующего вещества в том же количестве, что и животные из группы высшей дозы. По два животных из группы контроля и группы высшей исследуемой дозы использовали для оценки по окончании 14-дневного периода наблюдения после прекращения введения исследуемого соединения. Состояние животных оценивали 2 раза/сут в течение периода введения XC221GI и далее по 1 разу/сут в течение периода наблюдения. Расширенное обследование проводили 1 раз/нед. Офтальмоскопию проводили до начала введения XC221GI, после его прекращения и по окончании периода наблюдения. До начала применения исследуемого соединения, через 1 и 3 ч после введения и по окончании периода наблюдения регистрировали температуру тела, ЧДД и оценивали АД неинвазивным методом (S+Bmed VET, Германия); измеряли ЭКГ с использованием электрокардиографа SEIVA ECG Praktik Veterinary (SEIVA, Чехия). До начала введения XC221GI, по окончании ведения и в конце периода наблюдения отбирали образцы крови для клинического и биохимического анализа (общий белок, альбумин, глобулин, отношение альбумина и глобулина, глюкоза, общий билирубин, электролиты, холестерин, триглицериды, креатинин, щелочная фосфатаза, трансаминазы, гамма-глутамилтранспептидаза, лактатдегидрогеназа), а также для оценки свёртывающей системы крови, что включало анализ общего количества тромбоцитов, активированного частичного тромбопластинового (АЧТВ) и протромбинового (ПВ) времени. Для клинического анализа использовали гематологический анализатор Pentra 60 C+ (Horiba ABX, Франция), для биохимического анализа крови ― анализатор Dimension Vista 500 (Siemens Healthcare Diagnostics, Германия). АЧТВ и ПВ определяли коагулометром STart 4 (Diagnostica Stago, Франция). Отбирали мочу для общего анализа до и после окончания введения препарата, а также после окончания периода наблюдения. Для анализа мочи использовали анализатор Urilyzer 100 Pro с тест-полосками Combi Screen PLUS (Analyticon Biotechnologies AG, Германия).

Образцы крови для токсикокинетического исследования отбирали у животных из групп низкой, средней и высокой исследуемых доз (по 3 самца и 3 самки из каждой группы) на 1-е и 28-е сут периода введения XC221GI непосредственно до и в течение 24 ч после введения XC221GI. Для определения плазменных концентраций XC221GI применяли валидированную методику высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС/МС) с использованием хромато-масс-спектрометрической системы Quattro Premier XE (Waters, США) и хроматографической колонки Kinetex 1.7μm HILIC 100 Å, 100×2.1 (Phenomenex, США); нижний предел количественного определения для XC221GI составлял 20 нг/мл, для его метаболита XC221A (5-([2-(1-метил-1H-имидазол-4-ил)этил]амино)-5-оксогексановая кислота) ― 2 нг/мл. В ходе токсикокинетического исследования определяли фармакокинетические параметры XC221GI и образуемого путём гидролиза метаболита XC221A. После введения последней дозы XC221GI умерщвляли всех животных из групп низкой и средней доз и по 3 животных из групп контроля и высшей дозы. Остальных животных умерщвляли по окончании периода наблюдения. Для умерщвления использовали внутривенное введение барбитуратов. Во всех случаях выполняли макроскопическое патологическое исследование. Животных, умерщвлённых после периода наблюдения, использовали для гистопатологического исследования печени, почек, лёгких, системы кроветворения, репродуктивной системы.

Мутагенный потенциал

Определение потенциальных метаболитов XC221GI. XC221GI инкубировали с микросомами печени человека и микросомами печени крыс в течение 5–45 мин. Из среды инкубации отбирали образцы, в которых методом ВЭЖХ-МС/МС (API6500, API6500+ и API4000, колонки ACQUITY-BEH-C18 и Hypersil GOLD aQ) оценивали содержание оставшегося XC221GI. XC221GI инкубировали с рекомбинантными изоферментами цитохрома P450 (cytochrome P450, CYP) для оценки потенциально ответственного за метаболизм соединения фермента. Использовали CYP1A2 (контроль ― фенацетин), CYP2B6 (контроль ― бупропион), CYP2C18 (стандарт ― паклитаксел), CYP2C9 (стандарт ― диклофенак), CYP2C19 (контроль ― S-мефенитоин), CYP3A4 (контроль ― мидазолам) и CYP2D6 (контроль ― буфуралол).

Тест Эймса. В первой серии экспериментов тест Эймса проводили с использованием Salmonella typhimurium штаммов TA97, TA 98 и TA100. Микроорганизмы инкубировали с XC221GI в 1% растворе полисорбата-80. В экспериментах без метаболической активации использовали XC221GI в концентрациях 0,23; 2,27; 22,73; 227,27 или 2272,73 мкг/мл, при метаболической активации соединение применяли в концентрации 0,19; 1,85; 18,52; 185,19 или 1851,85 мкг/мл. Для метаболической активации применяли S9 фракцию гепатоцитов самцов крыс линии Вистар, которые за 5 дней до отбора клеток печени внутрибрюшинно получали Совол в дозе 300 мг/кг. Длительность инкубации составляла 48 ч. Тест считали положительным при превышении числа ревертантных колоний под воздействием исследуемого соединения в ≥2 раза по сравнению с показателем, полученным для отрицательного контроля. Во второй серии экспериментов для теста Эймса использовали S. typhimurium ТА98, ТА100, ТА1535 и ТА1537 Escherichia coli WP2 uvrA в условиях метаболической активации в присутствии S9 фракции печени крыс (индуктор фенобарбитал/β-нафтофлавон) и без метаболической активации. Исследование включало предварительный тест на растворимость, тест на цитотоксичность, начальный и подтверждающий тесты на мутацию. Выбор исследуемого диапазона концентраций основывался на результатах теста определения диапазона концентраций и рекомендациях руководства OECD⁴(OECD Test No. 471: Bacterial Reverse Mutation Test) для растворимых нетоксичных соединений. Для этих соединений максимальная рекомендуемая исследуемая концентрация составляет 5000 мкг на чашку. XC221GI использовали в концентрации 16; 160; 500; 1600 или 5000 мкг на чашку.

Тест на индукцию хромосомных аберраций. Первый эксперимент провели на клетках лёгкого китайского хомячка линии V79 в соответствии с руководством OECD (OESD Test No. 473: In vitro Mammalian Chromosome Aberration Test). Для цитогенетических экспериментов выбраны концентрации XC221GI 250; 500; 1000; 2000 мкг/мл на основании результатов предварительного теста без метаболической активации и с метаболической активацией в присутствии S9 фракции гепатоцитов крыс. В качестве положительного контроля использовали растворы этилметансульфоната в концентрациях 0,4 или 1,0 мкл/мл или циклофосфамида 5 мкг/мл. По окончании инкубации клеточные культуры обрабатывали колхицином в концентрации 0,2 мкг/мл за 2,5 ч до отбора клеток.

Кластогенный и анеугенный потенциал соединения XC221GI изучали в микроядерном тесте на клетках млекопитающих in vitro в соответствии с руководством OECD (OECD. Test No. 487: In Vitro Mammalian Cell Micronucleus Test). Исследование провели на лимфоцитах периферической крови человека с метаболической активацией в присутствии S9 фракции печени самцов крыс линии Вистар (индуктор Ароклор 1254) и без неё. На основании результатов предварительного тестирования были выбраны 3 исследуемые концентрации соединения XC221GI ― 1; 2 и 5 мг/мл культуры. В качестве носителя использовали воду для инъекций. В эксперименте использовали положительный контроль (колхицин в финальной концентрации 0,1 мкг/мл, циклофосфамид в финальной концентрации 0,1 мкг/мл) и негативный контроль (вода для инъекций). Для предоставления результатов использовали методы описательной статистики.

Для изучения влияния XC221GI на хромосомные аберрации in vivo использовали мышей линий CBA×C57ВL/6 (масса тела 20–22 г). На первом этапе животные (самцы, n=5 в группе) однократно внутрибрюшинно получали XC221GI в дозе 2,86 мг/кг или 2000 мг/кг. Самцам мышей (n=5 в группе) из группы положительного контроля внутрибрюшинно вводили циклофосфамид в дозе 20 мг/кг, в качестве отрицательного контроля использовали носитель (1% раствор полисорбата-80). На втором этапе исследования мышам (5 самцов и 5 самок в группе) внутрижелудочно вводили XC221GI в дозе 2,86 мг/кг в сутки или носитель в течение 5 дней. На обоих этапах через сутки после завершения дозирования мышей умерщвляли смещением шейных позвонков, за 2–3 ч до умерщвления вводили 0,01 мл/г 0,04% раствора колхицина. Получали образцы костного мозга из бедренных костей; из осадка образцов готовили препараты, окрашивали красителем Романовского и выполняли анализ не менее 100 метафазных пластинок.

Тест щелочной элюции. Тест комет дезоксирибонуклеиновой кислоты (тест ДНК-комет) проводили для оценки генотоксического и канцерогенного потенциала. Эксперимент проводили с использованием самцов-гибридов первого поколения мышей линий CBA×C57ВL/6 (масса тела 20–22 г). Животные (n=10 в группе) однократно внутрижелудочно получали XC221GI в 1% растворе полисорбата-80 в дозе 36; 360 или 3600 мг/кг. В качестве положительного контроля использовали мышей, которым однократно внутрижелудочно вводили циклофосфамид в дозе 50 мг/кг; положительным контролем служили мыши, получавшие носитель. Половину животных умерщвляли смещением шейных позвонков через 3 ч после дозирования, остальных ― через 18 ч. Изолировали бедренные кости, срезали эпифизы, вымывали клетки костного мозга охлаждённым фосфатным буфером с добавлением этилендиаминтетраацетата (ЭДТА) в концентрации 20 ммоль/л и 10% диметилсульфоксида. Печень, почки и селезёнку изолировали, готовили гомогенаты. Препараты подготовленных клеток окрашивали SYBR Green (разведение 1:10 000 в буфере TE с 50% раствором глицерина), выполняли флюоресцентную микроскопию и получали цифровые изображения препаратов; при помощи программного обеспечения CASP 1.2.2 анализировали содержание ДНК в хвосте ДНК-комет. Статистический анализ проводили методом Даннета.

Репродуктивная токсичность

Во всех экспериментах использовали половозрелых самцов и самок крыс. XC221GI вводили внутрижелудочно в 1% растворе полисорбата-80 в суточной дозе 17,4 или 174 мг/кг, эквивалентной ТД и 10 ТД для человека. Животные из контрольных групп получали носитель.

Влияние на фертильность. Самки крыс (n=20 в группе) получали исследуемое соединение или носитель в течение 15 дней (3 эстральных цикла), затем их на 10 дней помещали в клетку к интактным самцам. Исходно, во время беременности и на 20-й день беременности оценивали массу тела самок. На 20-й день беременности половину животных умерщвляли, оценивали число жёлтых тел в яичниках и мест имплантации в матке, а также число мёртвых и живых плодов. За оставшимися самками наблюдали в течение месяца после родов: оценивали развитие, физическое состояние, динамику массы тела и смертность потомства. Индекс фертильности рассчитывали как отношение числа беременных самок к числу самок, подсаженных к самцам (%). В эксперименте на самцах животные (n=10 в группе) получали XC221GI или носитель на протяжении 48 дней, после чего их помещали в одну клетку с интактными самками. Оценивали число мёртвых и живых плодов у самок.

Влияние на эмбриофетальное развитие. Беременные самки крыс (n=10 в группе) с 1-го по 19-й день беременности получали XC221GI или носитель. На 20-й день беременности самок умерщвляли, извлекали плоды и оценивали массу плодов, затем проводили патоморфологическое исследование внутренних органов по Стейплсу, скелета ― методом Доусона с окрашиванием ализарином.

Влияние на пренатальное и постнатальное развитие. Беременные самки крыс (n=10 в группе) получали XC221GI или носитель с 6-го дня беременности до родов. После родов оценивали число живых и мёртвых крысят, на 7-е и 21-е сутки после рождения измеряли массу тела потомства F₁, оценивали признаки нарушения постнатального развития (сроки отлипания ушных раковин, появления первичного волосяного покрова, открытия глаз и прорезывания резцов). Для оценки неврологического развития потомства проводили тесты на отрицательный геотаксис, маятниковый рефлекс, переворачивание на плоскости, избегание обрыва, обонятельную реакцию, реакцию на акустический стимул, переворачивание в свободном падении, спонтанную двигательную активность, а также тест «открытое поле».

Аллергизирующее действие

Аллергизирующее действие изучали на морских свинках-альбиносах (масса тела 250–300 г) и гибридах первого поколения мышей линий CBA×C57ВL/6. Морским свинкам вводили XC221GI в дозе 15,5 или 155 мг/кг, что соответствовало ТД и 10 ТД для человека. В качестве положительного контроля использовали овальбумин. У морских свинок проводили тест на индукцию системной и кожной анафилаксии, гиперчувствительность немедленного и замедленного типа при накожном или интраконъюнктивальном нанесении. При оценке системной анафилаксии рассчитывали анафилактический индекс по Weigle. Оценку гиперчувствительности замедленного типа выполняли также у мышей [8].

Иммунотоксичность

Эксперименты проводили на самцах гибридов первого поколения мышей линий CBA×C57ВL/6 (масса тела 20–22 г, n=10 в группе). XC221GI в дозе 28,6 или 286 мг/кг в сутки или носитель вводили внутрижелудочно в течение 21 дня. В последний день дозирования внутрибрюшинно вводили суспензию эритроцитов барана (2,5×10⁸ клеток); через 7 дней мышей умерщвляли и отбирали образцы крови, в которых оценивали содержание гемагглютининов (реакция гемагглютинации с эритроцитами барана) и гемолизинов (метод микротитрации с использованием эритроцитов барана и комплемента морских свинок с помощью микротитратора «Такачи») в сыворотке крови для оценки влияния XC221GI на гуморальное звено иммунитета. В другом опыте со схожим дизайном животных умерщвляли на 5-й день после иммунизации; из селезёнки получали кровь, в которой оценивали фагоцитарную активность в тесте с тетразолиевым красителем, а также выполняли оценку розеткообразования для оценки Т- и В-клеточного звена иммунитета. При оценке влияния на гиперчувствительность замедленного типа животные получали XC221GI в дозе 28,6 или 286 мг/кг в сутки или носитель внутрижелудочно в течение 10 дней; в последний день дозирования внутрибрюшинно вводили суспензию эритроцитов барана (2,5×10⁸ клеток). Разрешающую дозу эритроцитов барана (10⁸ клеток) вводили субплантарно через 5 дней, спустя сутки оценивали толщину подушечки лапы.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Токсичность при однократном введении

В дозе 5000 мг/кг при внутрижелудочном введении соединение XC221GI не вызывало гибели мышей независимо от пола. Изменений в поведении животных не отмечали, на следующий день после дозирования состояние мышей оставалось в пределах нормы. Как и мыши, все крысы выжили после внутрижелудочного введения XC221GI в дозе 5000 мг/кг. Дозирование не приводило к появлению внешних признаков токсичности, на следующий день после введения состояние животных оставалось в пределах физиологической нормы.

Токсичность при многократном введении

Исследование по подбору доз. В экспериментах не выявили признаков токсичности или других нежелательных эффектов при однократном внутрижелудочном введении крысам XC221GI в диапазоне доз от 90 до 2000 мг/кг. Признаков токсичности XC221GI не зарегистрировали и при многократном введении соединения крысам в диапазоне доз от 18 до 450 мг/кг. Клинически значимых изменений уровней эритроцитов, лейкоцитов, коагулограммы не наблюдалось. Показатели биохимического анализа крови также клинически значимо не изменялись. При однократном пероральном введении крысам XC221GI доза без видимого нежелательного эффекта (No Observed Adverse Effect Level, NOAEL) составила 2000 мг/кг, при многократном пероральном введении в течение 14 сут ― 450 мг/кг.

Исследования на крысах

Двухнедельное исследование токсичности. На фоне ежедневного внутрижелудочного введения XC221GI в дозе 17,4–87 мг/кг в сутки выжили все крысы. Статистически значимых различий жизненно важных показателей по сравнению с данными, полученными у животных на фоне введения носителя, не обнаружили (p >0,05 во всех случаях межгруппового сравнения). Прирост массы тела в течение периода дозирования и восстановительного периода были сопоставимыми у животных всех групп (p >0,05 во всех случаях межгруппового сравнения). Среди самцов и самок показатели ЭКГ, АД, ЧДД и поведения в тесте «открытое поле» у животных из опытных групп статистически значимо не отличались от данных, полученных на фоне введения носителя. Параметры клинического анализа крови были сопоставимыми у животных всех групп как на 15-й, так и на 30-й день исследования. Параметры общего анализа мочи как на 15-й, так и на 30-й день исследования были сопоставимыми у крыс обоих полов всех групп (p >0,05 во всех случаях межгруппового сравнения). В ходе патоморфологического исследования установили соответствие изученных структур животных контрольной и опытной групп физиологической норме. Масса внутренних органов у самцов и самок на 15-й и 30-й дни исследования была сопоставимой у особей всех групп (p >0,05 при межгрупповом сравнении).

Исследование токсичности с тридцатидневным дозированием. При введении XC221GI внутрижелудочно в дозе 17,4–174 мг/кг в сутки самкам и самцам аутбредных крыс на протяжении месяца все животные выжили. На протяжении дозирования и восстановительного периода общее состояние животных, их внешний вид, потребление корма и воды оставались удовлетворительными. Введение исследуемого соединения не приводило к отклонениям в показателях ЭКГ, АД, ЧДД и поведения в тесте «открытое поле». Различий в показателях клинического анализа крови и общего анализа мочи не обнаружено. При патоморфологическом исследовании как у самцов, так и у самок группы высокой дозы XC332GI отмечали увеличение относительной массы печени на 31-й день (p <0,05 при сравнении с показателем, полученным на фоне введения носителя). К концу восстановительного периода масса печени животных группы высокой дозы была сопоставима с показателем, полученным у крыс контрольной группы (p >0,05 при межгрупповом сравнении). Отклонений гистологической картины печени и других органов не обнаружено.

Трёхмесячное исследование токсичности. За 3 мес дозирования не зарегистрировано гибели животных. Влияние XC221GI на прирост массы тела было в целом сопоставимо с результатами, полученными в месячном эксперименте. Отклонений в показателях ЭКГ, АД, ЧДД на протяжении всего эксперимента не выявлено (p >0,05 во всех случаях межгруппового сравнения). У самцов после 3 мес введения XC221GI по результатам теста «открытое поле» наблюдали статистически значимое дозозависимое повышение общей двигательной активности, числа пересечённых секторов и стоек (p <0,05 во всех случаях сравнения с показателем, полученным у крыс контрольной группы). У самок, напротив, XC221GI в дозе 87 или 174 мг/кг в сутки вызывало снижение общей двигательной активности и числа пересечённых секторов (p <0,05 во всех случаях сравнения с показателем, полученным у крыс контрольной группы). Независимо от пола, за месяц после прекращения дозирования отмечали восстановление показателей в тесте «открытое поле» (p >0,05 во всех случаях межгруппового сравнения). В клиническом анализе крови и общем анализе мочи показатели оставались сопоставимыми на протяжении всего эксперимента. У самцов соединение XC221GI не оказывало влияния на показатели биохимического состава крови. Среди самок после 3 мес дозирования отмечали небольшое, но статистически значимое увеличение активности АЛТ в сыворотке крови у особей группы высокой дозы и снижение активности АСТ у животных групп средней и высокой дозы (p <0,05 во всех случаях межгруппового сравнения). При патоморфологическом исследовании отмечали только статистически значимое повышение относительной массы печени и щитовидной железы у самок группы высокой дозы XC221GI (p <0,05 по сравнению с показателем, полученным у крыс контрольной группы), которое разрешалось к концу восстановительного периода. Изменение массы органов не сопровождалось отклонениями их гистологической структуры.

Исследования на кроликах

В исследованиях на кроликах с двухнедельным, тридцатидневным и трёхмесячным дозированием независимо от дозы не обнаружили клинически значимого влияния исследуемого соединения на общее состояние, внешний вид, прибавку массы тела, потребление пищи и воды среди кроликов (p >0,05 во всех случаях сравнения с показателями, которые получили на фоне введения носителя). Показатели ЭКГ, ЧДД, клинического и биохимического анализа крови, а также общего анализа мочи оставались сопоставимыми на протяжении всего исследования (p >0,05 во всех случаях межгруппового сравнения). При патоморфологическом исследовании не обнаружили клинически значимого влияния исследуемого соединения на массу, макроскопическую и микроскопическую структуру внутренних органов.

Исследование токсичности и токсикокинетики на собаках

Статистически значимые изменения массы тела, потребления пищи и температуры тела на фоне введения XC221GI отсутствовали (p >0,05). При обследовании, включая офтальмоскопию, не выявили патологических изменений. Показатели ЭКГ, ЧДД и АД статистически значимо не различались у животных опытных и контрольной групп (p >0,05). Клинически значимых изменений в результатах общего и биохимического анализов крови и общего анализа мочи не выявлено. При оценке массы внутренних органов не обнаружили изменений, связанных с исследуемым соединением. Введение XC221GI не вызывало макроскопических или гистопатологических изменений в печени и почках, которые могли бы указывать на наличие токсического эффекта. Со стороны желудочно-кишечного тракта и других органов также не выявлено макроскопических и микроскопических изменений. Таким образом, для собак доза без наблюдаемого эффекта (No Observed Effect Level, NOEL) составляла 30 мг/кг в сутки.

Результаты токсикокинетического анализа (табл. 1) подтвердили уровень системной экспозиции XC221GI, соответствующий результатам исследования токсичности, при этом наиболее высокие значения C_max зарегистрировали у животных группы высшей дозы XC221GI. Коэффициенты кумуляции рассчитывали для XC221GI и XC221A отдельно для каждой дозы. Коэффициенты кумуляции для XC221GI и XC221A после введения дозы 60 мг/кг были выше 1,25, поэтому для высшей исследуемой дозы была подтверждена кумуляция для обоих соединений. Доля площади под фармакокинетической кривой (area under curve, AUC) для метаболита XC221A по отношению к доле AUC для XC221GI рассчитывалась отдельно для каждой дозы. Доля AUC «концентрация-время» от начального момента времени до последней определяемой концентрации во временной точке t (AUC_0-t) XC221A от AUC_0-t XC221GI была максимальной для дозы 60 мг/кг (от 10,8 до 16,76%) и наименьшей для дозы 6 мг/кг (от 4,6 до 11,8%). Пропорциональность доз была рассчитана для параметров C_max, AUC_0-t, и AUC «концентрация-время» от начального момента времени до бесконечности (AUC_0-∞) в 1-й и 28-й дни была подтверждена на основании C_max и AUC для XC221GI по результатам дисперсионного анализа (p <0,05) и коэффициенту детерминации (R² >0,90). Для C_max и AUC_0-t не выявили половых различий для всех исследуемых доз и дней введения препарата (день 1 и день 28).

 

Таблица 1. Токсикокинетические показатели соединения XC221GI у собак породы бигль, получавших XC221GI перорально в течение 28 сут в различных дозах / Table 1. Toxicokinetic indicators ХС221GI in beagle dogs treated ХС221GI orally within 28 days

Группа	XC221GI
	6 мг/кг в сутки		30 мг/кг в сутки		60 мг/кг в сутки
Количество животных	3 самца	3 самки	3 самца	3 самки	3 самца	3 самки
XC221GI после введения первой дозы в день 1
Cmax, нг/мл	1100±214	1079±170	4536±738	4363±789	6650±1430	7113±2164
tmax, ч	0,7±0,3	0,7±0,3	0,4±0,1	0,5±0,0	0,7±0,3	0,6±0,4
Kel, ч	1,2±0,2	1,2±0,3	0,3±0,1	0,3±0,1	0,3±0,3	0,2±0,0
t1/2, ч	0,6±0,1	0,6±0,1	2,3±0,9	2,5±1,1	3,8±2,4	3,0±0,3
AUC0-t, нг*ч/мл	1385±570	1343±561	10 462±3843	11 011±3820	12 607±3769	15 206±1645
AUC0-∞, нг*ч/мл	1481±672	1439±672	10 573±4013	11 203±3910	12 782±3769	15 356±1602
MRT, ч	1,2±0,3	1,2±0,3	2,4±0,9	2,9±1,4	2,7±1,2	2,8±0,5
XC221GI после введения последней дозы в день 28
Cmax, нг/мл	1128±576	1109±567	4246±966	4734±328	5974±1314	9026±1937
tmax, ч	0,7±0,3	0,7±0,3	0,7±0,3	0,4±0,1	0,8±0,3	0,4±0,1
Kel, ч	1,0±0,9	1,0±0,5	0,4±0,2	0,3±0,1	0,3±0,1	0,2±0,1
t1/2, ч	0,8±0,4	0,8±0,4	2,0±1,1	2,1±0,4	3,5±1,9	4,0±2,2
AUC0-t, нг*ч/мл	1771±1290	1750±1317	9730±4612	9674±2679	14 102±3646	20 845±6933
AUC0-∞, нг*ч/мл	1823±1288	1799±1317	9884±4616	9779±2665	14 289±3776	21269±7157
MRT, ч	1,4±0,4	1,4±0,4	2,4±0,9	2,1±0,2	2,9±0,9	3,2±0,8

Примечание. C_max ― максимальная концентрация; t_max ― время достижения максимальной концентрации; K_el ― константа элиминации; t_1/2 ― период полувыведения; AUC_0-t ― площадь под фармакокинетической кривой «концентрация-время» от начального момента времени до последней определяемой концентрации во временной точке t; AUC_0-∞ ― площадь под фармакокинетической кривой «концентрация-время» от начального момента времени до бесконечности; MRT ― среднее время удерживания.

Note: C_max ― maximum concentration; t_max ― is the time to reach the maximum concentration; K_el ― elimination constant; t_1/2 ― half-life; AUC_0-t ― the area under the pharmacokinetic curve “concentration-time” from the initial moment to the last determined concentration at the time point t; AUC_0-∞ ― the area under the pharmacokinetic curve “concentration-time” from the initial moment to infinity; MRT ― mean retention time.

 

Мутагенный потенциал

Определение потенциальных метаболитов XC221GI. При инкубации XC221GI с микросомами печени в течение 45 мин отношение концентраций исходного соединения XC221GI и его гидролитического метаболита XC221A составляло 0,09 при использовании микросом печени крыс и 0,08 при использовании микросом печени человека.

При инкубации XC221GI с изоферментами CYP не обнаружили ингибирующего действия соединения на CYP1A2, CYP2C9, CYO2C19, CYP2D6, CYP3A4, CYP2B6 или CYP2C8.

Тест Эймса. В тесте Эймса без метаболической активации, независимо от использованных штаммов микроорганизмов, результаты были отрицательными. В экспериментах с метаболической активацией S9 фракцией гепатоцитов крыс XC221GI во всех исследуемых концентрациях также не повышал частоты обратных мутаций.

Тесты на индукцию хромосомных аберраций. В экспериментах на клетках лёгкого китайского хомячка линии V79 не отмечали существенного увеличения числа аберрантных клеток при сравнении с показателями, полученными в контрольных экспериментах. В условиях метаболической активации при концентрации XC221GI 1000 или 2000 мкг/мл частота аберраций находилась в пределах референсных значений (5 аберрантных клеток без хроматидных разрывов / 150 клеток при референсном показателе 2–5), однако 95% доверительные интервалы (ДИ) незначительно превышали контрольные пределы (4,11 и 4,34 аберрантных клеток, исключая пробелы / 150 клеток). Существенных статистически значимых различий во всех случаях не обнаружено (p >0,05). Полиплоидных или эндоредуплицированных метафаз не зарегистрировали ни в одном эксперименте. По результатам теста соединение XC221GI классифицировано как некластогенное вещество.

После однократного введения XC221GI частота выявления аберрантных метафаз составляла 0,6%, независимо от дозы соединения, что было сопоставимо с результатами, полученными при введении носителя (p >0,05 при межгрупповом сравнении). После введения циклофосфамида частота выявления аберрантных метафаз составляла 27,2% (p <0,05 по сравнению с показателем, полученным при введении носителя).

При многократном внутрижелудочном введении XC221GI или носителя самцам крыс частота выявления аберрантных метафаз составляла 0,6% (p >0,05 при межгрупповом сравнении). У самок после введения носителя показатель составил 0,6%, а при дозировании исследуемого соединения ― 0,8% (p >0,05 при межгрупповом сравнении).

Микроядерный тест. В микроядерном тесте на клетках млекопитающих in vitro не выявили статистически значимого (p >0,05 при сравнении с контролем) повышения доли бинуклеарных клеток с микроядрами в клеточных культурах для исследуемых концентраций XC221GI. При проведении повторных тестов с использованием тех же концентраций XC221GI не зарегистрировали увеличения доли аберрантных клеток. Не наблюдали дозозависимого увеличения доли аберрантных клеток. Таким образом, соединение XC221GI не оказывало кластогенного или анеугенного действия в отношении культуры лимфоцитов периферической крови человека.

Тест щелочной элюции. Результаты теста ДНК-комет у мышей после 3 ч экспозиции представлены в табл. 2. На фоне введения циклофосфамида во всех клетках отмечали статистически значимое повышение содержания ДНК в хвосте ДНК-комет, что указывало на повышение частоты разрывов ДНК (p <0,05 во всех случаях сравнения с показателем, полученным при введении носителя).

 

Таблица 2. Содержание ДНК в хвосте ДНК-комет после 3 ч экспозиции, % / Table 2. Content of DNA in the tail of DNA-comets after 3 h of exposure, %

Группа	Печень	Почки	Селезёнка	Костный мозг
Носитель	5,55±0,49	5,52±0,41	5,18±0,37	5,79±0,51
Циклофосфамид, 50 мг/кг	17,32±1,42†	15,18±1,61†	7,44±0,68†	15,74±1,74†
XC221GI, 36 мг/кг	5,83±0,50	6,58±0,54	6,33±0,61	6,65±0,35
XC221GI, 360 мг/кг	6,58±0,52	5,71±0,62	5,85±0,16	6,7±0,51
XC221GI, 3600 мг/кг	6,71±0,52	6,38±0,30	5,53±0,31	7,08±0,19

Примечание. Данные представлены в виде средних значений и стандартных ошибок среднего. ^† ― различия достоверны по сравнению с контрольной группой (p <0,05, критерий Даннета). ДНК ― дезоксирибонуклеиновая кислота.

Note: The data is presented in the form of averages and standard errors of the mean. ^† ― differences are significant compared with the control group (p <0.05, Dunnett’s test). DNA ― dezoxyribonucleic acid.

 

Соединение XC221GI ни в одной из исследованных доз не повышало частоты разрывов ДНК, содержание ДНК в хвосте ДНК-комет оставалось сопоставимым с показателем, полученным у мышей группы отрицательного контроля, во всех типах клеток (p >0,05 во всех случаях межгруппового сравнения). При увеличении времени экспозиции до 18 ч результаты оставались сопоставимыми.

Репродуктивная токсичность

Влияние на фертильность. Введение XC221GI самкам крыс до спаривания не оказывало влияния на изменение массы тела животных. Не выявили изменений частоты постимплантационной гибели плодов и изменения индекса фертильности (p >0,05 при сравнении с показателями, полученными на фоне введения носителя). В постнатальном периоде развитие потомства протекало без отклонений, включая сроки отлипания ушных раковин, появления первичного волосяного покрова, прорезывания зубов и открытия глаз (p >0,05 при сравнении с показателем, полученным у потомства самок контрольной группы). У самок, которые спаривались с самцами, получавшими XC221GI, не отмечали повышения частоты пред- и постимплантационной гибели эмбрионов. Индекс фертильности был сопоставим с показателем, полученным на фоне введения самцам носителя. Повышения частоты аномалий развития плодов также не наблюдали.

Влияние на эмбриофетальное развитие. Темпы прироста массы тела у самок основных групп не отличались от показателей, полученных у животных контрольной группы (p >0,05 при межгрупповом сравнении). Частота предимплантационной гибели плодов и постимплантационная смертность были сопоставимы между группами (p >0,05 при межгрупповом сравнении). Отклонений внутриутробного развития среди потомства животных, которые получали XC221GI, не наблюдали. Развитие скелета у потомства самок, получавших исследуемое соединение, было сопоставимо с таковым у потомства крыс контрольной группы.

Влияние на пренатальное и постнатальное развитие. Все крысята родились живыми, средняя масса тела была сопоставимой у потомства самок всех групп как на 7-й, так и на 21-й день после рождения (p >0,05 при межгрупповом сравнении). Сроки отлипания ушей, появления первичного волосяного покрова, прорезывания зубов и открытия глаз не отличались у потомства животных опытных и контрольной группы (p >0,05 при межгрупповом сравнении). Не обнаружено существенных различий в результатах тестов по оценке неврологического развития потомства (p >0,05 при межгрупповом сравнении).

Аллергизирующее действие

XC221GI не вызвал анафилактического шока ни у одной морской свинки (индекс Weigle составил 0 баллов). В тесте активной кожной анафилаксии диаметр зоны распределения красителя после внутрикожного введения разрешающей дозы XC221GI не превышал 3 мм, что указывало на отрицательный результат эксперимента. У морских свинок при интраконъюнктивальном или накожном нанесении XC221GI не отмечено развития реакций гиперчувствительности замедленного или немедленного типа, у мышей введение исследуемого соединения также не вызывало гиперчувствительности замедленного типа.

Иммунотоксичность

У мышей введение XC221GI в дозе 28,6–286 мг/кг внутрижелудочно не оказывало влияния на формирование гемагглютининов и гемолизинов в ответ на введение эритроцитов барана. В других экспериментах не выявлено воздействия XC221GI на интенсивность реакции гиперчувствительности замедленного типа, реакцию розеткообразования и фагоцитарную активность нейтрофилов крови.

Местнораздражающее действие

В ходе исследований токсичности при многократном внутрижелудочном введении крысам или кроликам в течение 2 нед–3 мес при проведении аутопсии не обнаруживали существенных признаков раздражения или повреждения слизистой оболочки желудка.

ОБСУЖДЕНИЕ

Полученные результаты свидетельствуют об отсутствии у ХС221GI токсического действия при многократном длительном применении и позволяют считать профиль безопасности нового соединения обоснованно благоприятным.

Изучение острой и хронической токсичности ХС221GI на 5 видах животных (мыши, крысы, морские свинки, кролики, собаки) показало, что все исследуемые животные хорошо переносили введение ХС221GI. Значимые изменения в поведении животных, потреблении ими корма и воды не отмечались. На всём протяжении периодов дозирования и восстановления гибель животных не зарегистрирована. В экспериментах in vivo не выявлено признаков токсичности или других нежелательных эффектов при однократном введении ХС221GI аутбредным мышам и крысам обоих полов в дозе 5000 мг/кг (максимальная доза для определения класса токсичности химических веществ в соответствии с ГОСТ 12.1.007-76⁵), а также при многократном введении крысам, кроликам и собакам обоих полов в исследованиях с двухнедельным, четырёхнедельным, тридцатидневным и трёхмесячным дозированием XC221GI в широком диапазоне доз (от 6 до 174 мг/кг в сутки), что с учётом коэффициентов межвидовых пересчётов соответствовало ТД, 5 ТД и 10 ТД для человека (суточная ТД для человека составляет 200 мг).

Системная экспозиция ХС221GI при введении в дозе 30 мг/кг в сутки собакам превышала возможную у человека в 10 раз, согласно результатам клинического исследования фармакокинетики возрастающих доз препарата при однократном и многократном пероральном применении у здоровых добровольцев (NCT03459391).

К моменту завершения восстановительного периода все показатели клинического (количество эритроцитов, уровень гемоглобина, среднее содержание гемоглобина в клетке, средняя концентрация гемоглобина в клетке, средний объём эритроцита, гематокрит, количество лейкоцитов, лейкоцитарная формула, количество тромбоцитов) и биохимического (активность АЛТ, АСТ, щелочной фосфатазы, гамма-глутамилтранспептидазы, лактатдегидрогеназы, уровень креатинина, мочевины, триглицеридов, глюкозы, общего белка, альбуминов, глобулинов, холестерина и соотношение альбуминов и глобулинов, общий билирубин, электролиты) анализов крови, коагулограммы (общее количество тромбоцитов, АЧТВ, ПВ), общего анализа мочи (удельная масса, pH, содержание билирубина, кетоновых тел, глюкозы, белка, эритроцитов и лейкоцитов) были сопоставимыми у животных всех групп. Параметры ЭКГ, АД, ЧДД и показатели поведения в тесте «открытое поле» у животных опытных групп статистически значимо не отличались от данных, полученных на фоне введения носителя.

При патоморфологическом исследовании у животных контрольных и опытных групп макроскопическая и гистологическая структура внутренних органов соответствовала физиологической норме. Кроме того, при проведении аутопсии не обнаруживали существенных признаков раздражения или повреждения слизистой оболочки желудка, что свидетельствовало об отсутствии у препарата местнораздражающего действия.

В панели стандартных in vitro и in vivo тестов (тест Эймса, тест на индукцию хромосомных аберраций, микроядерный тест, тест щелочной элюции) в широком диапазоне доз было подтверждено отсутствие у ХС221GI цитотоксического, мутагенного, генотоксического и канцерогенного потенциала.

Установлено, что ХС221GI не метаболизируется в печени, не влияет на систему цитохромов печени человека.

При изучении репродуктивной токсичности ХС221GI на половозрелых самцах и самках крыс в суточной дозе 17,4 или 174 мг/кг, эквивалентной ТД и 10 ТД для человека, не выявлены изменения частоты постимплантационной гибели плодов и изменения индекса фертильности, а также влияние на эмбриофетальное, пренатальное и постнатальное развитие.

В исследовании по изучению иммунотоксичности не выявили отрицательного воздействия ХС221GI на гуморальное (оценка антителообразования у животных) и клеточное (индукция реакции гиперчувствительности замедленного типа, количество Т- и В-лимфоцитов по реакции розеткообразования) звено иммунитета, активность фагоцитов (оценка фагоцитарной и бактерицидной активности фагоцитирующих клеток разной локализации). В исследовании аллергизирующего действия XC221GI в дозе, эквивалентной 1 и 10 ТД для человека, не вызвал развития реакций гиперчувствительности замедленного или немедленного типа у исследуемых животных, не обладал анафилактогенным потенциалом.

Таким образом, интегральная оценка токсикологического профиля позволяет классифицировать ХС221GI как малотоксичное соединение и отнести к IV классу токсичности в соответствии с ГОСТ 12.1.007-76⁶.

Представленные результаты исследования токсикологического профиля препарата ХС221GI дополняют известные данные о его фармакодинамической активности и позволяют выделить преимущества этого препарата при использовании в качестве средства упреждающей противовоспалительной терапии COVID-19 в сравнении с рядом схем стандартной терапии COVID-19 [9]. К этим преимуществам ХС221GI относится уникальный антицитокиновый профиль, позволяющий минимизировать избыточное подавление функций иммунной системы, благоприятный профиль метаболической безопасности в сравнении с глюкокортикостероидами и ингибиторами янус-киназ (барицитиниб, тофацитиниб) (COVID-19 Treatment Guidelines, 2021), а также небелковая химическая структура, исключающая характерные для препаратов моноклональных антител (тоцилизумаб, сарилумаб, левилимаб, анакинра) иммунологические риски [10–13].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ХС221GI в серии исследований острой и хронической токсичности у грызунов и негрызунов не проявлял нежелательного действия в отношении желудочно-кишечного тракта, а также сердечно-сосудистой, дыхательной, нервной и мочеполовой систем, не обладал местнораздражающим действием, не вызывал признаки метаболических сдвигов во внутренней среде организма.

Не выявлено отрицательного влияния ХС221GI на форменные элементы крови, систему кроветворения и гемостаза.

Величина NOAEL для ХС221G1 составила при однократном пероральном введении крысам 2000 мг/кг, при пероральном введении крысам в течение 14 сут ― 450 мг/кг в сутки, при пероральном введении собакам в течение 28 дней ― 30 мг/кг в сутки.

В панели стандартных in vitro и in vivo тестов ХС221GI не проявлял цитотоксических, мутагенных, генотоксических и канцерогенных свойств.

ХС221GI не обладал анафилактогенным и иммунотоксическим действием, не проявлял аллергизирующих свойств, а также не оказывал репродуктивной токсичности.

Таким образом, профиль безопасности нового соединения ХС221GI при многократном длительном применении является обоснованно благоприятным.

ДОПОЛНИТЕЛЬНО

Источник финансирования. Работа финансировалась ООО «Фарминтепрайзес» (Россия) и АО «Валента Фарм» (Россия).

Конфликт интересов. Сотрудники ООО «Фарминтепрайзес» (Россия) отвечали за организацию и проведение исследований, научное консультирование и рецензирование публикации. Сотрудники АО «Валента Фарм» (Россия) участвовали в анализе данных и подготовке публикации.

Вклад авторов. Все авторы внесли существенный вклад в проведение поисково-аналитической работы и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию до публикации. Наибольший вклад распределён следующим образом: С.А. Суханова, О.В. Проскурина, А.В. Рыдловская, В.Е. Небольсин ― поисково-аналитическая работа; Е.А. Джайн, А.А. Глобенко, М.И. Багаева — написание статьи, направление рукописи на публикацию.

Благодарность. Авторы выражают благодарность ООО «Статэндокс» (Россия) за помощь в подготовке публикации.

ADDITIONAL INFORMATION

Funding source. Тhe work was funded by Pharmenterprises LLC (Russia) and JSC Valenta Pharm (Russia).

Competing interest. Employees of Pharmenterprises LLC (Russia) were responsible for the organization and conduct of research, scientific advice and review of the publication. Employees of JSC Valenta Pharm (Russia) participated in the data analysis and preparation of the publication.

Authors’ contribution. Аll authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the work, final approval of the version to be published. S.A. Suhanova, O.V. Proskurina, A.V. Rydlovskaya, V.E. Nebolsin ― search and analytical work when writing a review article; E.A. Jain, A.A. Globenko, M.I. Bagaeva — writing an article, the direction of the manuscript for publication.

Acknowledgement. The authors are grateful to Statendox LLC (Russia) for assistance in preparing the publication.

 

¹ Межгосударственный стандарт. Режим доступа: https://docs.cntd.ru/document/1200115791. Дата обращения: 15.02.2021.

² Режим доступа: https://docs.cntd.ru/document/420350679. Дата обращения: 15.02.2021.

³ International Association of Veterinary Editors. Consensus Author Guidelines on Animal Ethics and Welfare for Veterinary Journals. [Internet]. Режим доступа: https://static1.squarespace.com/static/53e16b74e4b0528c244ec998/t/543acda6e4b094d04bcacacd/1413139878532/IAVE-AuthorGuidelines.pdf. Дата обращения: 15.02.2021.

⁴ Organisation for Economic Co-operation and Development. Режим доступа: https://www.oecd.org/. Дата обращения: 15.02.2021.

⁵ Межгосударственный стандарт. ГОСТ 12.1.007-76. Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности. Режим доступа: https://docs.cntd.ru/document/5200233. Дата обращения: 15.02.2021.

⁶ Межгосударственный стандарт. ГОСТ 12.1.007-76. Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности. Режим доступа: https://docs.cntd.ru/document/5200233. Дата обращения: 15.02.2021.

Об авторах

Светлана Алексеевна Суханова

Всесоюзный научный центр по безопасности биологически активных веществ

Email: ssuhanova46@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-0548-4249

к.б.н.

Россия, Старая Купавна

Оксана Владимировна Проскурина

Всесоюзный научный центр по безопасности биологически активных веществ

Email: proskurina_ov@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-5718-3301

к.м.н.

Россия, Старая Купавна

Екатерина Александровна Джайн

Валента Фарм

Автор, ответственный за переписку.
Email: ekaterina.korsakova@valentapharm.com
ORCID iD: 0000-0003-0283-8598

руководитель группы доклинических исследований АО «Валента Фарм»

Россия, Москва

Александр Александрович Глобенко

Валента Фарм

Email: Aleksandr.Globenko@valentapharm.com
ORCID iD: 0000-0001-9295-2663

медицинский директор

Россия, Москва

Мадина Ибрагимовна Багаева

Валента Фарм

Email: madina.bagaeva@valentapharm.com
ORCID iD: 0000-0002-4577-1832

медицинский советник

Россия, Москва

Анастасия Владимировна Рыдловская

Фарминтерпрайсез

Email: rydlovskaya@pharmenterprises.ru
ORCID iD: 0000-0003-0241-156X

к.б.н.

Россия, Москва

Владимир Евгеньевич Небольсин

Фарминтерпрайсез

Email: nv@pharmenterprises.ru
ORCID iD: 0000-0001-5939-9341

к.х.м.

Россия, Москва

Список литературы

Дополнительные файлы