Structure and mechanism of action of botulinum and tetanus neurotoxins (literature review)

Full Text

Введение

История изучения бактериальных токсинов началась с выделения дифтерийного токсина в 1888 году бактериологами Эмилем Ру и Александром Йерсеном [1]. В настоящее время известно, что бактериальные токсины прицельно воздействуют на определенные физиологические функции животных и человека, нарушая их. Многие из токсинов достигают цитозоля клеток-мишеней и изменяют специфические клеточные компоненты [2]. Эти токсины, действующие внутриклеточно, развивались как многодоменные белки с различными механизмами действия и разнообразными клеточными мишенями. Выделение и описание бактериальных токсинов привели к разработке анатоксинов, что стало одним из главных триумфов медицины в двадцатом веке [3].

Наиболее сильные токсины воздействуют на нервную систему и называются нейротоксинами. Предметом изучения данного обзора литературы являются ботулинические нейротоксины (БнТ) и столбнячный нейротоксин (СтН), занимающие лидирующие позиции в перечне самых сильных из известных на сегодняшний день токсинов [4]. В частности, установлено, что БнТ примерно в 100 миллиардов раз более токсичен, чем цианид [5]. Столбняк и ботулизм представляют собой заболевания, патогенез которых связан с воздействием белковых нейротоксинов, выделяемых спорообразующими бактериями рода Clostridium. Клостридии существуют в анаэробной окружающей среде и кишечнике животных, преимущественно в виде спор. При благоприятных условиях споры прорастают, и бактерии могут вырабатывать нейротоксины [6]. Известны несколько изоформ СтН и множество изоформ БнТ, которые сгруппированы в один серотип СтН и 7 серотипов БнТ (обозначены буквами A, B, C, D, E, F и G) [7]. Серотипы включают множество изотипов, отличающихся друг от друга последовательностью аминокислот, влияющей на их нейротоксичность [8]. Изотипы обозначаются арабскими цифрами, следующими за заглавной буквой серотипа. У человека заболевание вызывают преимущественно три серотипа БнТ — А, В и Е. Бактерии C. botulinum фенотипической группы III, помимо нейротоксинов С и D, продуцируют также токсины С/D и D/С, которые представляют собой мозаичные токсины, возникающие, как считается, в результате генетической рекомбинации между генами синтеза токсинов С и D. К мозаичным токсинам относится и недавно описанный нейротоксин Н, представляющий собой гибридоподобную структуру, содержащую области двух токсинов – А1 и F5 [9]. Иммунитет после перенесенного заболевания типоспецифический, поэтому возможно повторное заражение человека [10].

Несколько изоформ СтН и множество изоформ БнТ, известных в настоящее время, очень похожи с точки зрения аминокислотной последовательности, трехмерной структуры и биохимического механизма действия в нейронах. Тем не менее, СтН и БнТ вызывают две разные формы нейропаралича (спастический и вялый, соответственно), поскольку воздействуют на разные типы нейронов: СтН парализует центральные тормозные интернейроны спинного мозга, в то время как БнТ парализуют периферические и влияют на центральные холинергические нейроны [11].

Столбняк был описан еще Гиппократом, который впервые определил основные симптомы спастического паралича при данном заболевании [12]. Симптомы ботулизма начинаются с паралича черепно-мозговых нервов, птоза и диплопии, за которыми следует нарушение глотания. Затем паралич постепенно распространяется на скелетные и дыхательные мышцы, включая диафрагму, что приводит к нарушению дыхания и смерти [10]. Паралич дыхательных путей и скелетных мышц сопровождается поражением холинергических нейронов вегетативной нервной системы с сопутствующими симптомами [13]. Воздействие БнТ и СтН не сопровождается анатомическим повреждением и некрозом нейронов, что делает возможным их восстановление при нейтрализации токсина [10]. Фактически, нейротоксины, попадая внутрь нейронов, имеют ограниченный жизненный цикл, который зависит от ряда факторов, включая чувствительность нейронов и восприимчивость нейротоксинов к механизмам внутриклеточной деградации белка [14].

 

Строение и механизм действия СтН и БнТ

СтН и БнТ представляют собой белки, которые состоят из легкой (L, молекулярная масса 50 кДа) и тяжелой цепи (H, молекулярная масса 100 кДа), соединенных между собой дисульфидным мостиком и свернутых в четыре домена, каждый из которых играет определенную роль в воздействии на нервные окончания [15]. Легкая цепь сворачивается в N-концевой домен и представляет собой цинк-зависимую эндопептидазу, специфичную по отношению к одному или трем белкам-компонентам комплекса SNARE (VAMP, SNAP-25, синтаксин). Мембранные белки SNARE опосредуют нейроэкзоцитоз и высвобождение нейромедиаторов в синаптическую щель [3, 8].

L-цепь окружена пептидным поясом, образованным доменом HN (N-концевая часть тяжелой цепи, 50 кДа). Этот домен характеризуется двумя длинными α-спиралями и дополнительными более короткими спиралями, расположенными вокруг межцепочечной дисульфидной связи [11]. Домен HN, способствующий транслокации L-цепи в цитозоль, связан с карбоксильным концом тяжелой цепи H массой 50 кДа, которая в свою очередь состоит из двух доменов, называемых HC-N (молекулярная масса 25 кДа) и HC-C (молекулярная масса 25 кДа). HC-N опосредует нейротоксичность, хотя его точная роль до конца не выяснена и может отличаться для разных серотипов СтН и БнТ [16]. Имеются свидетельства в пользу того, что HC-N участвует в связывании токсина путем взаимодействия с отрицательно заряженными липидными микродоменами [17]. В свою очередь, HC-C отвечает за нейроселективность СтН и БнТ и за их внутринейронный транспорт, который обусловливает периферическую активность БнТ и центральную активность СтН после его периферического захвата и ретроградного аксонального транспорта в спинной мозг [14, 18, 19].

Разные пути транспорта СтН и БнТ внутри нейронов не являются взаимоисключающими, поскольку СтН может вызывать локальный периферический паралич, а БнТ могут ретроградно мигрировать внутри нейронов и высвобождаться в ЦНС на различных уровнях [14, 20]. И СтН, и БнТ воздействуют на свои специфические мишени – пресинаптические нервные окончания – посредством аналогичного механизма, связанного с их модульной структурой и состоящего из пяти основных этапов: связывание с пресинаптической мембраной, интернализация связанного токсина в цитозоль посредством эндоцитоза, транслокация  L-цепи в цитозоль с помощью домена HN, разрушение межцепочечной дисульфидной связи с высвобождением L-цепи для экспрессии ее каталитической активности (как металлопротеазы) в цитозоле, и избирательное расщепление одного или более белков комплекса SNARE с последующей блокадой высвобождения нейромедиатора.

Рассмотрим каждый из пяти перечисленных этапов подробнее.

 

Этап 1. Нейроселективное связывание с периферическими нервными окончаниями

СтН и БнТ связываются с высокими уровнями селективности и аффинности с пресинаптической плазматической мембраной посредством взаимодействия с полисиалоганглиозидами, которыми богаты нервные окончания и белковые рецепторы [18, 21]. Полисиалоганглиозиды содержат олигосахаридную часть, включающую несколько отрицательно заряженных сиаловых кислотных остатков, которые выступают над немиелинизированными поверхностями пресинаптической мембраны нейронов, что облегчает связывание крупных белков, таких как нейротоксины или иммуноглобулины, специфичные для олигосахаридов [7, 22]. Этому способствует тот факт, что полисиалоганглиозиды заряжены отрицательно и встроены в мембранные участки, содержащие анионные липиды [23, 24], в то время как белки СтН и БнТ представляют собой диполи, в которых домен связывания заряжен положительно. Это позволяет переориентировать молекулу БнТ по мере его продвижения к мембране, увеличивая вероятность связывания с рецептором [22, 25].

 

Этап 2. Интернализация связанного токсина

Связывание СтН и БнТ с полисиалоганглиозидами позволяет токсинам осуществлять диффузию через липидную пресинаптическую мембрану, что значительно увеличивает вероятность их связывания с вторым рецептором. Доступные данные свидетельствуют, что БнТ связываются с люминальным доменом интегрального белка, присутствующим на мембране синаптических везикул [11]. Этот белок представляет собой либо синаптотагмин-1/2 для БнТ типов B, D/C и G, либо синаптический везикулярный гликопротеин 2 (SV2) для БнТ типов A и E, а также СтН [26]. В дальнейшем нейротоксины проникают внутрь просвета синаптических везикул [11].

Синаптотагмин представлен 13 изотипами белка (Syt1 – Syt13). Молекула синаптотагмина включает N-концевой трансмембранный фрагмент, связывающий элемент и два домена C2 (C2A и C2B), связывающих кальций. Домен C2A связывает три иона кальция, в то время как C2B связывает два иона. Синаптотагмин является кальциевым сенсором, который участвует в последних стадиях выброса нейромедиатора в синаптическую щель. Он связывается с нейрексином и SNAP-25, осуществляя удержание секреторной везикулы у пресинаптической мембраны, и участвует в выбросе нейромедиатора за счет регуляции белков комплекса SNARE при увеличении содержания кальция [27]. Кальций не связывается напрямую и не модифицирует комплекс SNARE, однако, кальций-связывающие белки, о которых известно, что они расположены вблизи активных зон, действуют как посредники. В нейронах изоформы синаптотагмина 1 и 2 являются основными чувствительными к кальцию белками, которые регулируют образование ядер SNARE, а также стыковку, праймирование и слияние везикул. Также известно, что домены C2 связывают фосфолипиды, такие как фосфосерин и фосфоинозитолфосфаты, и облегчают слияние везикул и плазматической мембраны. Фосфатидилинозитол-4,5-дифосфат (PIP2) является важным компонентом плазматической мембраны, необходимым для SNARE-опосредованного слияния мембран. Показано, что синаптотагмин-1 взаимодействует непосредственно с PIP2, облегчая восприятие кальция доменом C2 [28].

SV2 представляют собой трансмембранные белки, присутствующие на каждом секреторном пузырьке (включая синаптические пузырьки), и имеющие решающее значение для нейротрансмиссии. Результаты проведенных структурных и функциональных исследований позволяют предполагать, что белки SV2 могут играть несколько ролей в обеспечении правильной везикулярной функции. Среди этих ролей — их способность стабилизировать содержание медиатора в везикулах, поддерживать и ориентировать высвобождаемый пул везикул, а также регулировать чувствительность везикул к кальцию для обеспечения эффективного и скоординированного высвобождения медиатора [29].

У млекопитающих SV2 включает три изоформы (SV2A, SV2B и SV2C). Изоформа SV2A селективно экспрессируется в субпопуляции двигательных нервных терминалей медленных мышечных волокон, в то время как изоформы SV2B и SV2C экспрессируются в двигательных нервных терминалях [30]. SV2 содержит 12 трансмембранных спиралей. Его N- и С-концы находятся на цитозольной стороне. БнТ типа A распознает четвертый люминальный домен SV2 (SV2-L4) и может использовать все три гомолога в качестве своих рецепторов [26]. В исследованиях установлено, что БнТ типа E использует SV2 в качестве своего функционального рецептора, поскольку доказано, что связывание и проникновение БнТ типа E в нейроны, лишенные всех SV2, блокируется [31]. Исследования, проведенные на культивируемых нейронах гиппокампа и коры головного мозга, показали, что СтН использует SV2 в качестве своих функциональных рецепторов [32]. На сегодняшний день остается доподлинно неизвестным, имеют ли БнТ типов F и C свои собственные белковые рецепторы [26].

 

Ретроградный аксональный транспорт в ЦНС

Хотя по своей структуре СтН и БнТ очень похожи, столбняк, вызываемый СтН, резко отличается от ботулизма и характеризуется спастическим параличом. СтН продуцируется Clostridium tetani, у которой способность к токсинообразованию закодирована в плазмиде. Характерно, что возбудитель столбняка приобретает патогенные свойства только при попадании на повреждённые ткани живого организма, лишённые доступа кислорода.

И СтН, и БнТ нацелены на периферические двигательные нервные терминали, в которые они попадают, но важное различие между ними заключается в том, что L-цепи БнТ высвобождаются в цитозоль двигательных нейронов, а СтН преимущественно транспортируется ретроградно вдоль по аксону двигательного нейрона к соме [18]. Затем СтН высвобождается из двигательных нейронов и вновь попадает в соединительные тормозные нейроны, где L-цепь СтН окончательно высвобождается в цитозоль и блокирует высвобождение нейромедиатора. Потеря тормозного входа приводит к гиперактивности двигательных нейронов, что, в свою очередь, вызывает спастический паралич [26].

Белковый рецептор, ответственный за ретроградный аксональный транспорт СтН, долгое время оставался неизвестным. Результаты ранних исследований описывали проникновение СтН внутрь пула эндоцитарных везикул, называемых сигнальными эндосомами. При этом в качестве ключевого механизма приводился клатрин-зависимый эндоцитоз с последовательной активацией ГТФаз Rab5 и Rab7 для передачи нейротрофических сигналов от периферии к соме периферических нейронов [33]. Недавно полученные экспериментальные данные показали, что белки нидоген-1 и нидоген-2, обратимо взаимодействующие с базальной пластинкой, являются белковыми рецепторами, которые, наряду с полисиалоганглиозидами, отвечают за направление СтН в сигнальные эндосомы [19, 34]. Эти органеллы перемещаются посредством ретроградного аксонального транспорта до сомы и высвобождают СтН в цереброспинальную жидкость вблизи пресинаптической мембраны тормозных интернейронов, которые впоследствии связывают и эндоцитозируют токсин внутри синаптических везикул, аналогично БнТ [26].

 

Этап 3. Транслокация L-цепи в цитозоль

После высвобождения нейромедиатора синаптические везикулы извлекаются из плазматической мембраны и пополняются нейромедиаторами. Последний процесс происходит под влиянием трансмембранного градиента рН, создаваемого протонным насосом везикулярной АТФазы, который закисляет просвет синаптических везикул. Низкий уровень pH в просвете используется СтН и БнТ для транслокации их L-цепей в цитозоль посредством конформационного изменения молекулы токсина. В этом процессе участвует домен HN, который вставляется в мембрану синаптической везикулы, образует ионный канал и способствует транслокации L-цепи на цитозольную сторону мембраны [8]. Как именно это происходит, пока точно не установлено. Были предложены две модели, которые различаются в зависимости от предполагаемой функции, которую играет трансмембранный канал HN. Согласно первой модели, формирование канала HN является предварительным условием для транслокации L-цепи, т.е. L-цепь проходит через предварительно сформированный канал HN [35]. Другая модель предполагает, что канал образуется во время прохождения L-цепи через мембрану (или сразу после него), т.е. появление канала HN является следствием транслокации L-цепи [8].

 

Этап 4. Разрушение межцепочечной дисульфидной связи с высвобождением L-цепи для экспрессии ее каталитической активности в цитозоле

Во время транслокации и после нее L-цепь должна претерпеть конформационные изменения, и было установлено, что в этом процессе участвует Hsp90 – основной цитозольный белок-шаперон, участвующий в фолдинге белков. Соответственно, специфические ингибиторы Hsp90 предотвращают интоксикацию нервных терминалей, вызванную СтН и БнТ [36, 37]. На цитозольной поверхности синаптических везикул L-цепь остается дисульфидно связана с H-цепью. В завершение процесса транслокации дисульфидная связь разрушается под действием внутриклеточной редокс-системы тиоредоксинредуктаза (TrxR) – тиоредоксин (Trx), которая была обнаружена на цитозольной стороне мембраны синаптических везикул [38]. Система TrxR-Trx взаимодействует с Hsp90 и высвобождает L-цепь для экспрессии ее каталитической активности в цитозоле [37]. Специфические ингибиторы этой редокс-системы предотвращают развитие столбняка и ботулизма в экспериментах на мышах и действуют на все серотипы БнТ [39-41].

 

Этап 5. Избирательное расщепление белков комплекса SNARE с последующей блокадой высвобождения нейромедиатора

После высвобождения в цитозоль нейрона L-цепь действует как металлопротеаза и расщепляет один или несколько белков комплекса SNARE: VAMP является интегральным белком мембраны синаптической везикулы, в то время как SNAP-25 и синтаксин находятся на цитозольной поверхности пресинаптической мембраны. Они образуют гетеротримерный комплекс, который является основным механизмом для слияния мембран, обеспечивая высвобождение нейромедиатора в межсинаптическое пространство [42]. Открытие того, что СтН и БнТ расщепляют белки комплекса SNARE, предотвращая нейроэкзоцитоз медиаторов, стало наиболее убедительным экспериментальным доказательством существенной роли, которую играет комплекс SNARE в нейроэкзоцитозе [43]. Установлено, что синаптическая активность чрезвычайно чувствительна к расщеплению даже минимального количества SNAP-25. Эксперименты показывают, что расщепление 10-15% от общего внутриклеточного пула SNAP-25 достаточно для полной блокады высвобождения нейромедиатора [22].

Токсикология СтН и БнТ

Оба изучаемых нейротоксина воздействуют на различные части нервной системы, нормальное функционирование которых необходимо для выживания. Во всех случаях они доставляют внутрь нейронов-мишеней металлопротеазу, которая специфически расщепляет один за другим белки, необходимые для осуществления нормальной нейротрансмиссии. Сочетание нейроспецифичности, ферментативной активности и важности нейронов-мишеней для выживания делает СтН и БнТ самыми сильными ядами для млекопитающих [11]. Их токсичность варьируется в зависимости от рассматриваемой изоформы БнТ и пути проникновения. Пероральный и респираторный пути менее эффективны, чем внутримышечный, внутривенный или внутрибрюшинный. В настоящее время известен только один серотип СтН, а наименьшее значение полулетальной дозы при внутрибрюшинном введении у мышей составляет около 0,2 нг/кг, что соответствует фемтомолярной концентрации при условии равномерного распределения в циркулирующих жидкостях [44].

Недавно проведенный анализ доступной литературы показал, что для БнТ значения полулетальной дозы у мышей составляли от 0,02 до 5 нг/кг [44]. Полулетальная доза рекомбинантного БнТ типа D, равная 0,02 нг/кг при внутрибрюшинном введении мышам, значительно отличается от низкой токсичности БнТ типа D у людей [45], что иллюстрирует зависимость токсичности СтН и БнТ от вида животных. Ранее этот вопрос широко изучался для СтН [44], но сопоставимый набор данных по БнТ на сегодняшний день все еще отсутствует. Фактически, лишь немногие из многих десятков изоформ БнТ были изучены с точки зрения токсичности для различных животных, в том числе потому, что многие из них были идентифицированы только с помощью достижений компьютерной геномики [46]. Эволюция разных изоформ БнТ, вероятно, связана c особенностями физиологии и экологии каждого вида животных, включая беспозвоночных [47].

 

Заключение

Токсический потенциал СтН и БнТ является результатом направленного воздействия на физиологическую функцию, которая необходима для жизни всех позвоночных. Проведенные к сегодняшнему дню исследования раскрыли молекулярную основу действия СтН и БнТ, включая нейроспецифическое связывание и механизмы, опосредующие каталитическое расщепление белков нейроэкзоцитоза. Тем не менее, несколько вопросов остаются нерешенными: в частности, касающиеся деталей эндоцитоза токсина в синаптические везикулы, а также процесса транслокации L-цепи через мембрану синаптической везикулы и ее последующего высвобождения в цитозоль.

About the authors

Anna A. Skryabina

Pirogov Russian National Research Medical University, Ministry of health of Russia

Author for correspondence.
Email: anna.skryabina.85@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-2098-222X
SPIN-code: 3692-6818
Scopus Author ID: 57218875198

MD

Russian Federation, 117997, Ostrovityanova str.1, Moscow

Ekaterina S. Golenok

Email: katrinmoroz2012@yandex.ru
Russian Federation

Maxim M. Sobkh

Email: maxsobh@gmail.com
Russian Federation

Vladimir V. Nikiforov

Pirogov Russian National Research Medical University, Ministry of health of Russia; Academy of Postgraduate Education of the Federal Scientific and Clinical Center for Specialized Types of Medical Care and Medical Technologies

Email: v.v.nikiforov@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-2205-9674
SPIN-code: 9044-5289

MD, Dr. Sci. (Med.), Professor

Russian Federation, 117997, Ostrovityanova str.1, Moscow; Moscow

References