ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ ПРОЯВЛЕНИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ДОТ-ИММУНОАНАЛИЗА В АВТОНОМНОМ НАБОРЕ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ОРТОПОКСВИРУСОВ

Полный текст

Введение Исчезновение популяционного иммунитета к вирусу натуральной оспы как следствие отмены оспопрививания населения привело к увеличению заболеваний, вызываемыми другими патогенными для человека ортопоксвирусами, такими как вирус оспы обезьян, не только в естественном ареале их циркуляции, но и в неэндемичных для них регионах. Кроме того, такое положение создает угрозу преднамеренного высвобождения и использования вируса натуральной оспы или его модифицированных вариантов в качестве биологического оружия или агента биотеррора [1, 2]. Быстрая диагностика таких заболеваний имеет большое значение, поскольку от нее зависит скорость принятия решений по предотвращению распространения болезни и, в конечном итоге, эффективность профилактических, лечебных и карантинных мероприятий. Диагноз инфекции может быть подтвержден лабораторными методами, основанными на выявлении ДНК вируса или родоспецифических антигенов. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), в том числе его экспрессные варианты, чрезвычайно чувствительны [3], однако, выполнение ПЦР-анализа требует строго контролируемых лабораторных условий, дорогостоящего оборудования и реагентов [4]. Иммунохимические тесты менее чувствительны, чем ПЦР. Обычно они позволяют регистрировать специфические антигены в концентрациях свыше 0,1 нг/мл. Однако даже такая чувствительность может быть достаточна для регистрации возбудителя и постановки диагноза [5]. При этом, низкая чувствительность иммунодиагностики в значительной степени компенсируется оперативностью получения результатов и меньшей, чем ПЦР, прихотливостью к условиям выполнения анализа [6]. Ранее мы сообщали о разработке платформы иммунохимического теста на плоских белковых матрицах. Такие тесты чувствительны, полностью укомплектованы, не требуют энергообеспечения, снабжены встроенными контролями, просты в применении, выполняются оперативно и позволяют проводить визуальный учет результатов [7, 8]. Эти тесты основаны на дот-иммуноанализе с использованием иммунозолей золота и регистрацией результатов с помощью «золото-серебряного» усиления оптического сигнала. Важную роль в регистрации сигнала играет операция проявления золей золота. Ранее показано, что наилучшие результаты усиления оптического сигнала обеспечивают проявители на основе метола [9]. Однако с широким распространением цифровой фотографии повсеместно резко сократилось производство химреактивов для обработки фотоматериалов на основе серебра и, в частности, метола. В период 2010 - 2013 гг. метол исчез из каталогов отечественных и зарубежных производителей химикатов. В 2014 г. этот реактив вновь появился на рынке в нескольких модификациях, отличающихся от предлагаемых ранее. В связи с этим возникла необходимость оценки характеристик и выбора реагентов, наиболее подходящих для приготовления проявителя. Цель работы: во-первых, оценка доступных реагентов для приготовления проявителя, во-вторых, отработка технологии применения проявителя в автономных системах и, в-третьих, апробация этой технологии при использовании набора для экспрессного выявления поксвирусов. Материалы и методы Реактивы. В работе использовали реактивы, приобретенные в фирме Sigma-Aldrich, и отечественные реактивы с квалификацией не ниже «чда». Биокомпоненты. Вирус осповакцины (ВОВ), штамм 14 ЛИВП. Вирус культивировали на перевиваемой культуре клеток почки африканской зеленой мартышки (линия 4647) с использованием ростовой питательной среды ДМЕМ, содержащей 2% телячьей эмбриональной сыворотки. После достижения максимального цитопатического эффекта инфицированные клетки разрушали трехкратным замораживанием - оттаиванием и однократной обработкой ультразвуком. Вирусный материал осаждали центрифугированием при 14 000 об/мин в течение 2 ч при 4 °С. Инфекционный титр вируса определяли безагарозным методом бляшек на культуре клеток 4647. Биологическая активность препарата ВОВ составляла 6,9 × 108 БОЕ/мл. Ат1 - антитела класса IgG из гипериммунной по ВОВ сыворотки кролика и Ат2 - антитела класса IgG из нормальной сыворотки кролика выделяли осаждением с помощью сульфата аммония [10]. Иммунозоль (конъюгат). Получение золя золота (размер частиц 15 -17 нм) восстановлением тетрахлорзолотой кислоты цитратом натрия, определение дозы нагрузки золя Ат1 в коагуляционном тесте и процедуру нагрузки проводили, как описано ранее [11]. Дополнительную стабилизацию золя выполняли добавлением бычьего сывороточного альбумина (БСА) до 1%. Очистку иммунозоля проводили центрифугированием при 15000 g в течение 30 мин при 4 °С. Таким образом получен золь Au-Aт1. Белковые матрицы. Подложки белковых матриц вырубали с применением типографского пресса из синтетической бумаги на основе поливинилхлорида (ПВХ) Pentaprint марки PR-M480/09-07/8101-2D8 (Klöckner Pentaplast, Германия). Подложки отмывали дистиллированной водой и высушивали. Иммунореагенты захвата, разведенные на 5 мМ боратном буферном растворе (рН 6,0) наносили на лицевую сторону [12] каждой подложки аликвотами по 2 мкл. В верхней части белковой матрицы (тестовая зона) наносили специфические антитела Ат1, в средней части (зона отрицательного контроля) - антитела нормальной сыворотки Ат2, а в нижней (зона положительного контроля) - вирусный препарат ВОВ. Рабочие разведения иммунореагентов подбирали эмпирически. Матрицы высушивали в течение 20 ч при 50 °С, блокировали погружением на 2 ч в 0,2% раствор казеина на 0,01 М фосфатном буферном растворе (рН 7,4), тщательно просушивали и использовали в работе. Аналитические ванны. Анализ выполняли в полипропиленовых аналитических ваннах, заполненных готовыми растворами, за исключением ячеек одного из рядов, содержащих по одной таблетке (3,5 -4,0 мг) сухого компонента физического проявителя (смесь метола и лимонной кислоты в соотношении 2:5). Для отмывок использовали ФСБ-Т (0,02 М натрий-фосфатный буферный раствор с 0,8% NaCl, 0,1% твина 20 и 0,1% азида натрия, рН 7,2) и бидистиллированную воду; для разведения образцов - ФСБ-Т с 0,02% казеина, рН 8,0; для разведения иммунозолей - ФСБ-Т с 0,02% полиэтиленгликоля (20 000 кДа), рН 7,4. При получении проявителя в ячейки ванны с таблетками сухой смеси проявителя добавляли по 250 мкл бидистиллированной воды для растворения таблеток и непосредственно перед проявлением вносили в ячейки по 250 мкл 0,4 % раствора нитрата серебра. Для усиления и стабилизации окраски использовали раствор, содержащий 1% тиомочевины и 1% гидроксида натрия в бидистиллированной воде. Дот-иммуноанализ. Дот-иммуноанализ выполняли при температуре от 20 °С до 25 °С с объемом рабочих растворов в ячейках аналитической ванны 0,3 -0,4 мл. Готовили серии разведений вирусов на растворе для разведения образцов, смешивали каждое разведение с иммунозолем в соотношении 50:1, вносили их в 1-й ряд ванны и инкубировали матрицы в полученной смеси 25 мин., затем дважды отмывали матрицы ФСБ-Т и дважды дистиллированной водой, проявляли серебряным проявителем, отмывали водой, усиливали оптический сигнал обработкой матрицы щелочным раствором тиомочевины, ополаскивали водой и визуально учитывали результаты. Положительным считали образец, формирующий ясно различимое темное пятно в тестовой зоне белковой матрицы при интенсивном окрашивании зоны положительного контроля и отсутствии или слабой окраски в зоне отрицательного контроля. Схема анализа представлена на рис. 1. Результаты и обсуждение Разработанные нами автономные тест-системы включают в себя два основных элемента - это пластиковый гребень, каждый зубец которого представляет собой белковую матрицу с иммобилизованными в виде отдельных пятен иммунореагентами захвата, и многоячеечная аналитическая ванна, заполненная готовыми рабочими растворами [8]. При проведении анализа белковые матрицы приводят в контакт с исследуемыми образцами, а затем выполняют анализ, последовательно инкубируя и перенося пластиковый гребень по рядам аналитической ванны. В системе используются конъюгаты на основе коллоидного золота и «золото-серебряная» система усиления оптического сигнала. Учет результатов осуществляется по интенсивности окраски сенсибилизированных участков на зубцах гребня. Ранее нами отработана система визуализации золотых конъюгатов физическим проявлением в растворе, содержащем нитрат серебра и восстановитель в кислой среде [9]. В таком растворе происходит каталитическое восстановление серебра на поверхности частиц золота, вследствие чего места их локализации выявляются в виде пятен с тёмной окраской. Лучшей проявляющей системой для визуализации результатов дот-анализа признан раствор, содержащий 0,2% метола, 0,5% лимонной кислоты и 0,2% нитрата серебра. Время проявления матрицы в свежеприготовленном растворе составляет 7 -8 мин, а стабильность такого проявителя зависит от качества и чистоты используемых для его приготовления реагентов. Оценка качества реактивов для изготовления проявителя В течение 2017 г. были приобретены 6 препаратов метола (изготовленные, согласно документам, в 2016 г.): 2 образца фирмы Fluka, 2 образца фирмы Aldrich-Sigma и 2 партии (от разных дистрибьюторов) отечественного препарата фирмы «Реахим». Оба образца отечественного препарата по цвету (серо-черный) не соответствовали ГОСТ 25664-83 (видимо хранились длительно или в ненадлежащих условиях) и, хотя и обладали восстанавливающей активностью, не обеспечивали стабильности проявителя свыше 5 мин. Этот препарат был исключен из исследований. Импортные образцы метола разводили от 0,4% до 0,1% в растворах, содержащих 0,75%, 0,5% и 0,25% безводной лимонной кислоты в бидистиллированной воде. Растворимость всех образцов была примерно одинаковой, за исключением Methol (foto), Fluka, Кат. № 69750, который заметно отставал по времени от других препаратов. В приготовленные растворы добавляли 10% раствор AgNO3 (чда) до концентрации 0,2%, раствор перемешивали и быстро погружали в него матрицы. Перед погружением матрицы замачивали на 10 мин в бидистиллированной воде для удаления остатков буферных растворов с их поверхности. Проявляли матрицы 7 мин при комнатной температуре. Вид проявленных матриц приведен на рис. 2. Цифры под матрицами указывают время до потемнения проявителя в результате диффузного выпадения серебра (стабильность, мин). Анализ результатов, приведенных на рис. 2, позволяет сделать следующие выводы. Methol foto, Fluka, лот 69750 непригоден для использования в системе, т. к. он плохо растворяется, не обеспечивает достаточную стабильность проявителя и интенсивность оптических сигналов, а также провоцирует спонтанное выпадение серебра на белковые компоненты (проявляет IgG). Methol Fluka, лот 69749 похож по свойствам на препарат Fluka лот 69750, но работает немного чище и значительно контрастнее. Потенциально может быть использован в системе в концентрации 0,2%. 4-(Methylamino)phenol chemisulfate salt, Aldrich-Sigma, лот 320013 схож по свойствам с препаратом Fluka лот 69750, но обеспечивает более интенсивный оптический сигнал и более склонен к неспецифическому выпадению серебра при концентрациях метола более 0,2% и лимонной кислоты менее 0,5%. Потенциально может быть использован в концентрации 0,2% при рН 3,0 или 0,3% при рН 2,9. Ecol работает чище, чем другие импортные аналоги, обеспечивает в оптимальных условиях стабильность проявителя до 15 мин, быстро проявляет золото и серебро, не провоцирует ложных сигналов на белковых компонентах и дает достаточно контрастные оптические сигналы. Может использоваться в системе в концентрации 0,2% и 0,3% при рН 3,0. Таким образом, из оцененных образцов метола лучшим вариантом для применения в тесте является препарат Ecol. Этот реактив в оптимальных условиях работает наиболее чисто, обеспечивает контрастное проявление золота в течение 7 мин. и достаточную стабильность проявителя. Сравнивали следующие пять марок лимонной кислоты, приобретенных в течение 2017 г.: 1) Citric acid, anhydrous, reagent ACS, 99,5 % (Acros organics, #423565000); 2) Citric acid, reagent ACS, 99,5 % (Sigma-Aldrich, #251275); 3) Citric acid, 99 % (Sigma-Aldrich, # C0759); 4) Citric acid monohydrate, reagent ACS, 99,5% (Sigma-Aldrich, #33114); 5) Citric acid, farm, 99,9 % (AppliChem, #A-2351). Заметных различий между ними при приготовлении проявителя не выявлено. Таким образом, для приготовления сухой смеси проявителя можно использовать любой из этих препаратов. Нитрат серебра фоточувствительный препарат, в кристаллах которого на свету восстанавливаются частицы металлического серебра. Такие препараты не пригодны для визуализации результатов анализа, поскольку частицы восстановленного серебра дестабилизируют проявитель с ослаблением полезного оптического сигнала и интенсивным фоном за счет диффузного выпадения серебра на поверхность матрицы. В нашем исследовании была проведена сравнительная оценка трех препаратов нитрата серебра: 1) Silver nitrate, ACS reagent, 99,0 %, изготовлен в 2015 г., (Sigma-Aldrich, #209139); 2) Серебро азотнокислое, чда, 99,9 %, ГОСТ 1277-75, изготовлен в 1991 г. (Реахим, Россия); 3) Серебро азотнокислое, хч, изготовлен в 2008 г. (ПЗЦМ-Втормет, Россия). В результате оценки установлено, что два первых указанных препаратов серебра могут быть использованы для изготовления набора, а отечественный препарат производства ПЗЦМ-Втормет, несмотря на более высокую квалификацию (хч) и меньший срок хранения, вызывает дестабилизацию проявителя. Отработка способа приготовления и применения проявителя В оптимальных условиях раствор проявителя стабилен только в течение 10 -20 мин и должен быть приготовлен непосредственно перед применением. При обеспечении высокой чистоты приготовления раствор нитрата серебра стабилен и может храниться в темной склянке более одного года. Раствор метола существенно менее устойчив и может эффективно использоваться только в течение 1 -2 сут. Очевидно, что тест-система не может укомплектовываться таким запасным раствором и метол должен входить в ее состав в сухом виде. Для укомплектования автономного диагностического набора предложено использовать двухкомпонентный проявитель - таблетированную смесь метола и лимонной кислоты (сухой компонент) в соотношении 2:5 (мас./мас.), а также 0,4% раствор азотнокислого серебра (жидкий компонент). Экспериментально установлено, что метол в виде сухой смеси с лимонной кислотой в темной упаковке может храниться более 2 лет (срок наблюдения) при комнатной температуре без потери активности. Проблема комплектации в таком случае заключается в крайне малой дозировке порций этих компонентов. Для проявления одной матрицы необходимо 0,5 мл проявителя. Доза на 0,5 мл проявителя составляет для метола - 1,0 мг, а для лимонной кислоты - 2,5 мг. Массовая или объемная дозировка таких порций сопряжена с высокой погрешностью, способной негативно отражаться на результатах анализа (при этом наиболее сильное влияние на эффективность проявления оказывает изменение соотношения концентраций метола и лимонной кислоты в смеси (см. рис. 2), тогда как небольшие погрешности дозировки сбалансированной смеси в проявителе не оказывают заметного влияния на результаты анализа и интенсивность оптических сигналов). Наиболее просто дозирование сухих компонентов проявителя может быть осуществлено путем изготовления тритурационных таблеток [13]. Для изготовления таблеток массой 3,5-4 мг готовили гомогенную смесь с необходимыми пропорциями лимонной кислоты и метола (эти ингредиенты имеют разную дисперсность и должны быть тщательно измельчены и перемешаны). Необходимый объем полученной пудры помещали в стеклянную чашку Петри и увлажняли 80% этанолом до образования густой пасты. Этой пастой заполняли ячейки диаметром 1,8 мм силиконовой матрицы толщиной 1 мм и высушивали. При подборе режимов сушки смеси в матрице установлено, что первоначальная сушка при температуре выше 40 оС приводила к вытеканию смеси из ячеек вследствие повышения растворимости. Сушка при повышенных температурах на поздних стадиях имела следствием снижение скорости растворения таблеток. Первоначальная сушка под вакуумом приводила к вскипанию смеси, что делало таблетки рыхлыми, ломкими и трудно извлекаемыми из матрицы. Оптимальным признан режим сушки в течение 2 ч при комнатной температуре, а затем в течение 4 ч под вакуумом. Досушивание смеси под вакуумом повышало скорость растворения таблеток в стационарном режиме по сравнению с таблетками, высушенными при нормальном давлении. Сушку таблеток необходимо проводить без доступа прямого света, а при их хранении избегать света и влаги. В таких условиях сухой компонент сохраняет свои свойства более 2 лет. Вариабельность массы таблеток в диапазоне от 3,5 до 4 мг не сказывалась заметно на результатах проявления. Жидкий компонент проявителя представляет 0,4% раствор нитрата серебра в бидистиллированной воде, расфасованный во флаконы из темного стекла. При его приготовлении необходимо избегать попадания прямого света, а также тщательно следить за качеством воды и чистотой посуды. В наборе таблетки сухой смеси помещаются в пустых ячейках одного из рядов аналитической ванны. При выполнении анализа за 10 -15 мин до проявления в ячейки с сухой смесью вносится по 250 мкл бидистиллированной воды, а непосредственно перед проявлением - такой же объём 0,4% раствора нитрата серебра (введение равного объема жидкого компонента позволяет равномерно перемешать растворы). Время проявления 7-8 мин при температуре 20 оС. При проявлении серебро может образовывать отложения разной плотности с различной окраской (от коричневой до черной), что затрудняет учёт результатов. Чтобы устранить эту проблему, в схему анализа введён дополнительный этап стабилизации окраски. На этом этапе проявленную матрицу обрабатывали щелочным раствором тиомочевины, который переводит серебро в его сульфид, имеющий интенсивную и стойкую чёрную окраску. Апробация проявителя в дот-иммуноанализе для выявления ортопоксвирусов Для экспрессного выявления ортопоксвирусов отработан одностадийный вариант дот-анализа с использованием поликлональных антител. В отличие от процедуры дот-иммуноанализа, описанной в предыдущих публикациях [7, 8], где матрицу сначала инкубировали с исследуемым образцом, а затем обрабатывали иммунозолем, в экспрессном варианте инкубация с образцом и конъюгатом выполняется в одну стадию (рис. 1). За счет такого совмещения и уменьшения числа отмывок время анализа сокращается с 70 до 40 мин. Для оценки эффективности применения в анализе, описанного в предыдущем разделе двухкомпонентного проявителя, параллельно выполняли одностадийный дот-анализ серии разведений вирусного материала с использованием: - классической прописи физического проявителя, приготовленного из запасных растворов (рис. 3, Б), - двухкомпонентного проявителя (рис. 3, В) - двухкомпонентного проявителя с последующей стабилизацией оптического сигнала в щелочном растворе тиомочевины (см. рис. 3Г). Видно, что двухкомпонентный и классический проявители обеспечивают идентичные результаты, а применение стабилизатора окраски повышает контрастность проявленных пятен. Погрешности в массе таблеток в диапазоне 3,5-4,0 мг не оказывают заметного влияния на результаты проявления. Чувствительность метода во всех вариантах проявления составляет 5,4 × 104 БОЕ/мл. Заключение В автономных наборах для эффективного проявления результатов иммуноанализа с применением конъюгатов на основе коллоидного золота может использоваться двухкомпонентный проявитель, включающий таблетку сухой смеси, содержащей метол и лимонную кислоту в соотношении 2:3, и жидкий компонент - 0,4% раствор нитрата серебра. Необходим контроль качества реактивов, предназначенных для изготовления проявителя. Таблетки сухой смеси проявителя могут быть изготовлены путем формования увлажненной этанолом смеси метола и лимонной кислоты в ячейках силиконовой матрицы с последующей сушкой, при этом погрешности в массе таблеток в диапазоне 3,5-4,0 мг не оказывают заметного влияния на результаты проявления. Повышение контрастности и стабильности оптических сигналов может быть достигнуто путем обработки проявленной белковой матрицы щелочным раствором тиомочевины.

Об авторах

Александр Георгиевич Полтавченко

ФБУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

доктор биол. наук, вед. науч. сотр. отдела разработки и производства средств диагностики вирусных заболеваний ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора 630559, Новосибирская область, Россия, р.п. Кольцово

Анна Васильевна Ерш

ФБУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

канд. биол. наук, науч. сотр. лаб. иммунохимической диагностики ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора 630559, Новосибирская область, Россия, р.п. Кольцово

Мамедьяр Шакирович Азаев

ФБУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Email: azaev@vector.nsc.ru
доцент, доктор биол. наук, зав. отделом научно-методической подготовки персонала по работе с возбудителями особо опасных инфекций ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора 630559, Новосибирская область, Россия, р.п. Кольцово

Павел Владимирович Филатов

ФБУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

канд. биол. наук, науч. сотр. лаб. иммунохимической диагностики ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора 630559, Новосибирская область, Россия, р.п. Кольцово

Список литературы

Дополнительные файлы