ETIOLOGY OF SKIN LEISHMANIOSIS IN OF ENDEMIC REGIONS OF UZBEKISTAN ON THE EXAMPLE OF DZHIZAK REGION

Full Text

Лейшманиозы - это группа паразитарных природно-очаговых, преимущественно зоонозных, трансмиссивных заболеваний, распространенных в тропических и субтропических странах [1, 2]. В силу своих климато-географических условий Узбекистан является эндемичной территорией по кожным лейшманиозам (антропонозному и зоонозному), а также по висцеральному лейшманиозу [7]. Кожные лейшманиозы (КЛ) наиболее распространены и часто регистрируются лечебно-профилактическими учреждениями (ЛПУ). Клиническая диагностика КЛ из-за сходства с другими кожными заболеваниями требует паразитологического подтверждения [4, 11]. Это обусловливает гипо- и позднюю диагностику учреждениями практического здравоохранения, поэтому официальные данные зачастую не отражают истинной картины заболеваемости, особенно в регионах, ранее не считавшихся эндемичными. Джизакская область всегда считалась эндемичной по антропонозному кожному лейшманиозу, вызываемому Leishmania tropica [6, 7]. Учитывая природно-климатические условия, Джизакская область относится к зоне с резко континентальным климатом, который характеризуется жарким летом, сухой и сравнительно мягко зимой. Средняя температура в январе - +1 ºС, +4 ºС, в июле +26-28 ºС. За год выпадает до 400-500 мм осадков, вегетационный период длится 240-260 сут, относительная влажность составляет 78-80%, летом - 20-40%. Данные условия являются оптимальными для развития москитов рода Phlebotomus - переносчиков возбудителей лейшманиозов [5, 7, 9, 10]. В ходе ежегодных энтомологических работ, проводимых сотрудниками НИИ медицинской паразитологии им. Л.М. Исаева, наряду с P. sergenti, считающимся основным переносчиком АКЛ, в данном регионе встречаются также P. papatasii и P. сaucasicus, которые служат переносчиками зоонозного КЛ. “Золотым стандартом” установления диагноза лейшманиозов считается паразитологическая диагностика [3]. Однако морфологическое однообразие амастиготных форм паразита не дает возможности дифференцировать антропонозный и зоонозный КЛ [11]. Определение видового состава лейшманий, а также их переносчиков и природных резервуаров являются одним из важнейших моментов для разработки научно-обоснованных рекомендаций комплексной борьбы и профилактики кожного лейшманиоза [4]. В настоящее время для видовой идентификации возбудителей лейшманиозов широко используется методы PCR, PCR-RFL а так же REAL-Time PCR. Исследования, проведенные в Иране и Турции, показали, что чувствительность метода ПЦР-RFLP составила 96% и превосходит традиционное микроскопическое исследование мазков (64%) [12, 13]. Цель нашей работы - провести молекулярно-биологическое исследование материала, полученного от больных КЛ из Джизакской области и установить видовую принадлежность возбудителей. Материалы и методы Материалом для исследования послужили мазки из язв больных из Джизакской области с предварительным диагнозом КЛ. Мазки, полученные из язв пациентов, фиксировались на предметном стекле этанолом, окрашивались азуром II - эозином по Романвскому-Гимзе и микроскопировались с использованием иммерсионной системы. Параллельно собирались анамнестические и эпидемиологические данные, согласно которым все пациенты были в возрасте до 14 лет и в течение последних 1,5 лет не выезжали в другие регионы республики. Для ПЦР отбирались лишь те образцы, в которых микроскопически обнаруживались амастиготы лейшманий. Исследования проводились на базе НИИ медицинской паразитологии им. Л.М. Исаева (Узбекистан) при методической помощи коллег из Института Тропической медицины университета YONSEI (Республика Корея). При этом использовались как классический метод ПЦР (гель-электрофорез), так и Real-Time PCR. Далее продукты ПЦР были секвенированы для определения видовой принадлежности возбудителей. Классический гель-электрофорезный ПЦР проводился при помощи термоциклера российского производства «ТЕРЦИК», который имеет 4 блока, это дает возможность амплифицировать одновременно 40 образцов. Для визуализации результатов использовалась 1% агароза-гель и столик УФЛ VILBER LOURMAT. Real-Time PCR в свою очередь проводился на аппарате StepOnePlusTM Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts) производство США. Для молекулярно-биологических исследований использовали смыв с препаратов, содержащих амастиготы лейшманий. Соскобы получали путем предварительного замачивания препаратов в буфере для экстракции ДНК (TL), с дальнейшим отскабливанием с помощью скарификатора. Экстракцию ДНК проводили с использованием коммерческого набора GeneAll Exgene Tissue (GeneAll Biotechnology Co. LTD, Korea), следуя протоколу, описанному производителем. Для исследования одного ДНК образца готовился MasterMix объемом 24 мкл. С этой целью в предварительно автоклавированную 1.5 мл пробирку вливали по 1 мкл прямого праймера (R-5’CCA CCC GGC CCT ATT TTA CAA CAA -3’) и 1 мкл обратного праймера (F-5’СTT TTC TGG TCC TCC GGG TAG G-3’), 2,5 мкл 10*Taq буфера, 2,5 мкл dNTP буфера, 0,1 мкл Taq буфера, и 16,9 мкл дистилированной воды. После чего центрифугировали при помощи Mini Spin Eppendorf в течении 1 мин. Затем в стирильные 0,2-мл пробирки для ПЦР расспределили по 23 мкл уже приготовленного MasterMix и по 2 мкл экстрагированного ДНК образца. Готовые пробирки с образцами помещали в термоциклер, где проводилась амплификация по следующей заданной программе (рис. 1). Время амплификации на термоциклере занимает 73,5 мин. Для электрофореза использовали агарозогель и аппарат для электрофореза Helicon (пр-во Россия). Далее в каждую лунку агарозагеля помещали 8 мкл полученнного ПЦР-продукта от каждого образца, предварительно смешивая его с 2 мкл краски Louding dye. В первую лунку добавляли 3 мкл рUC 19 (стандартная краска). Разгонка осуществлялась в течение 25 мин при 150 V. По окончанию элекрофореза агарозагель помещали на источник УФ и фиксировали результаты. Одновременно с классическим гель-электрофарезным методом ПЦР нами была проведена амплификация ДНК материала на аппарате StepOnePlusTM Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA) с использованием кит-наборов от компании Enzo Biochem Inc.(NY, USA) в соответствии с инструкцией производителя. Амплификация производилась при 95 ºC в течение 10 мин с последующими 40 циклами при 95 ºC в течение 5 с, 53 ºC в течение 8 с и 72 ºC в течение 9 с c однократным получением флуоресценции в конце каждого этапа отжига. За усилением следовала программа плавления 95 ºC в течение 20 с, 40 ºC в течение 20 с, и окончательное повышение до 85 ºC со скоростью 0,2 ºC с непрерывным получением флуоресценции. Результаты В ходе микроскопического изучения мазков из язв 24 пациентов установлено, что амастиготные формы лейшманий определялись в 20 препаратах. При этом отмечалась классическая картина - амастиготы находились как внутри макрофагов, так и внеклеточно. Число паразитов в препаратах было очень разным - от 5-6 пораженных клеток на весь препарат, до 1-2 клеток в 10 полях зрения. Далее был проведен ПЦР-анализ положительных образцов по представленой выше методике. Результат исследования образцов представлен на рис. 2. В УФ диапазоне свечение фиксировалось в образцах № 2, 3, 4, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 и 21, что доказывает наличие в них ДНК рода Leishmania (рис. 2). В ходе анализа кривой плавления RT-PCR была выявлена закономерность, согласно которой результаты RT-PCR оказалось возможным сгруппировать в 3 группы (рис. 3, А). Первую группу составили 13 образцов (70%), в которых регистрировалась температура плавления 83,78 ± 0,5 ºC (рис. 3, Б). Во вторую группу вошли 4 образца (20%) с температурой плавления 85,12 ± 0,2 ºC (рис. 3, В). У третьей группы амплификация не выявила специфичных маркеров к использованным праймерам. В дальнейшем секвенировали 17 образцов. Данные секвенирования подтвердили выше приведенные предположения. Так, нуклеотидные последовательности 13 образцов соответствовали L. Major (температура плавления - 83,78 ± 0,5 ºC), а последовательности 4 образцов, в свою очередь - L. Tropica (85,12 ± 0,2 ºC). Обсуждение Таким образом молекулярно-биологический метод подтвердил наличие ДНК лейшманий в 17 образцах из 20. Разница в результатах может быть объяснена несколькими причинами. Наиболее вероятной из них является ошибка при микроскопической диагностике, когда за амастиготные формы лейшманий могли быть приняты грибки, артефакты и другие объекты, содержащиеся в отделяемом со дна язв нелейшманиозной этиологии. Так же не исключено, что содержание ДНК в исходном материале было недостаточным для проведения молекулярно-биологического анализа По результатам RT-PCR исследования можно предположить, что определенный вид лейшманий имеет специфичную видовую кривую плавления. Наличие данной закономерности позволит в будущем проводить диагностику видоспецифичности лейшманиозов при помощи RT-PCR без применения видоспецифичных праймеров, основываясь при этом только на показателях температуры плавления образцов. Проведенные исследования, показали что, в Джизакской области, которая традиционно считалась эндемичной по антропонозному КЛ, также встречается возбудитель зоонозного КЛ- L. tropica. При этом в исследованных нами образцах последний вид преобладает. Учитывая отсутствие в данном регионе условий существования большой песчанки - основного резервуара зоонозного КЛ, необходимо установить роль других резервуарных хозяев в циркуляции возбудителя. Такими животными вполне могут оказаться суслики, которые в большом количестве встречаются в данном регионе не только в дикой природе, но и на территории населенных пунктов.

About the authors

U. T Suvonkulov

L.M. Isaev Research Institute of Medical Parasitology, Ministry of Health of the Republic of Uzbekistan

Samarkand, 38 Isaev St., 140105

Olesya Djurabaevna Achilova

L.M. Isaev Research Institute of Medical Parasitology, Ministry of Health of the Republic of Uzbekistan

Email: aleska-9090@inbox.ru
scientific researcher of the Isaev Research Institute of Medical Parasitology, Samarkand, Uzbekistan Samarkand, 38 Isaev St., 140105

T. I Muratov

L.M. Isaev Research Institute of Medical Parasitology, Ministry of Health of the Republic of Uzbekistan

Samarkand, 38 Isaev St., 140105

Soon Yong Tai

Yonsei University

50 Yonsei-ro, Sinchon-dong, Seodaemun-gu, South Korea, 220003-220980 Seoul

Yi Myunhee

Yonsei University

50 Yonsei-ro, Sinchon-dong, Seodaemun-gu, South Korea, 220003-220980 Seoul

Yeong Kim Ju

Yonsei University

50 Yonsei-ro, Sinchon-dong, Seodaemun-gu, South Korea, 220003-220980 Seoul

V. S Turicin

St. Petersburg State Agrarian University, Ministry of Agriculture of Russia

Petersburg highway 2, 196601 St. Petersburg, Russia

References

Supplementary files