POLYMORPHISM OF EPSTEIN-BARR VIRUS LMP1 ONCOGENE IN NANAIANS, REPRESENTATIVES OF INDIGENOUS MINORITY OF THE RUSSIAN FAR EAST

Full Text

Введение Доказано, что вирус Эпштейна-Барр (ВЭБ), убиквитарно распространенный среди населения земного шара, также ассоциирован с целым спектром доброкачественных и злокачественных новообразований. К числу последних относят рак носоглотки (РНГ), лимфому Беркита, определенные гистологические варианты лимфомы Ходжкина, рака желудка и целый ряд других [1]. Важно отметить, что в различных географических регионах мира и этнических группах выявлены варианты ВЭБ, в ключевых генах которых обнаружены определенные наборы мутаций (замены, вставки и делеции), влияющие на их трансформирующие свойства и онкогенный потенциал. К числу функционально важных генов, с которыми связан трансформирующий и онкогенный потенциал ВЭБ, относится латентный мембранный белок 1 (LMP1), обладающий выраженным полиморфизмом [2]. Являясь мультифункциональным геном ВЭБ, его признанным онкогеном, LMP1 участвует в индукции целого ряда транскрипционных факторов (NF-kB, AP-1, STAT), оказывая влияние на изменение профиля внутриклеточной активности ряда сигнальных путей, что приводит к трансформации инфицированной клетки [3]. Показано, что уровень индукции различных сигнальных каскадов клетки часто зависит от определённых мутаций в последовательности этого онкогена [4]. Молекулярный анализ LMP1 различного клинического и географического происхождения позволил обнаружить генетические варианты гена, отражающие в ряде случаев их неодинаковую биологическую активность. Так, вариант LMP1, амплифицированный более 20 лет тому назад от больного раком носоглотки (РНГ) из Южных провинций Китая, региона эндемичного для этого новообразования, содержал делецию 30 пар нуклеотидов (п.н.) в С-терминальной области и кодировал соответствующий делетированный вариант белка (LMP1) [5]. Этот вариант LMP1, названный «Cao», проявлял выраженные трансформирующие свойства in vitro и оказался более туморогенным для мышей с выраженным комбинированным иммунодефицитом (SCID) по сравнению с LMP1 стандартного варианта ВЭБ, штамма В95.8 [6]. Опыты по трансфекции на клетках линии BALB/3T3 также подтвердили более высокий туморогенный потенциал LMP1-Cao по сравнению с LMP1-В95.8 [7]. Повышенную трансформирующую активность изолята LMP1-Cao связывают с наличием в его C-терминальной области делеции 30 п.н., которая ответственна за усиленную индукцию NF-kB. Позже было обнаружено, что штаммы ВЭБ, содержащие делетированные варианты LMP1, не только широко распространены в регионах, эндемичных для РНГ, но также встречаются и в других не эндемичных регионах мира. Более того, делетированные варианты LMP1 были амплифицированы из опухолевых клеток больных некоторыми ВЭБ-ассоциированными новообразованиями лимфоидного происхождения и даже здоровых лиц [8-10]. Проведенное нами ранее исследование, свидетельствует о том, что среди населения центрально-европейской части России доминирует штамм ВЭБ с низкодивергентным вариантом LMP1-B95.8, обладающий низкой трансформирующей активностью [11-13]. Какие штаммы ВЭБ и варианты LMP1 персистируют среди населения восточного региона России с большим числом малочисленных этносов - вопрос, который до сих пор остается не изученным. В этом плане представляют интерес проведение исследования среди одного из представителей коренного малочисленного народа Дальнего Востока, нанайцев, проживающих в Хабаровском крае по берегам Амура и его притоков. Важно отметить, что до массового заселения Дальнего Востока из центральных регионов России, где, как уже было упомянуто, преобладают низкодивергентные варианты ВЭБ, эта этническая группа локально размещалась на юго-восточных территориях РФ и восточных провинциях Китая, где могла быть инфицирована локальными штаммами этого вируса. Еще одной особенностью этой этнической группы является их низкая продолжительность жизни, которая к концу семидесятых годов прошлого века составляла 44 года, хотя в 80-е годы произошло некоторое повышение этого показателя. Рак, как известно, заболевание людей пожилого возраста, и при низкой продолжительности жизни ВЭБ обычно не успевает проявить свои онкогенные потенции. Исходя из вышесказанного, данное исследование впервые посвящено изучению полиморфизма LMP1 ВЭБ у коренного населения (нанайцев) и иммигрантов данного региона, который не является эндемичным для ВЭБ-ассоциированных патологий, но находится на границе с эндемичными по РНГ южными провинциями Китая. Полученные нами результаты убедительно показали, что российские образцы LMP1 по своим последовательностям близки к описанным ранее в литературе вариантам LMP1 из различных регионов мира, но обладают рядом уникальных мутационных особенностей. Материалы и методы Изучаемые группы и образцы ДНК В исследовании участвовало две группы населения Хабаровского края Дальнего Востока РФ. Одна группа состояла из 19 представителей коренного населения, нанайцев: 9 мужчин (47,4%) и 10 женщин (52,6%). Возраст вошедших в эту группу лиц колебался от 24 до 58 лет (медиана - 45,7 лет). Другая группа, состоящая из 28 лиц (мужчин 13, 46%; женщин 15, 54%), представляла собой иммигрантов Дальнего Востока из европейского части РФ. В эту группу вошли жители г. Комсомольска-на-Амуре, представители славянских народов России. Возраст вошедших в эту группу лиц колебался от 28 до 63 лет (медиана - 46,1 лет). Материалом для исследования служили образцы крови и смывов ротоглотки. Из собранных образцов биологического материала была экстрагирована ДНК, используя набор Проба-НК (ДНК-диагностика). Наличие ДНК подтверждали методом ПЦР с соответствующей парой праймеров к области гена GAPDH. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) На следующем этапе каждый образец ДНК изучали на присутствие гена LMP1 с помощью «гнездной» ПЦР, используя соответствующие пары праймеров: внешние - Eco3’: 5’-TCCAGGAGAATTCCCCATCTCGAGAGTG-3’ и 8785: 5’-CGACCCCAATCTGGATGTATTATTATGG-3’; и внутренние - Bam3’: 5’-GTTTTCGTGGATCCTTATACAGTA-3’ и 8702: 5’-GCTACCGATTCTGGCCATGAATCTGAC-3’, как было описано ранее [11]. Секвенирование Для секвенирования амплифицированных образцов LMP1 использовали метод, описанный Edwards и соавт., (1999) с небольшими модификациями [14]. Исследование проводили с помощью набора реактивов ABI PRISM® BigDye™ Terminator v. 3.1 с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом сиквенаторе ДНК ABI PRISM 3100-Avant. Обработку данных секвенирования проводили с помощью программ Sequence Scanner v.1.0, Vector NTI и Mega v. 2.1. Классификация LMP1 Полученные варианты LMP1 анализировали в соответствии с предложенными ранее классификациями [15-17]. Филогенетический анализ Полученные последовательности гена LMP1 ВЭБ с использованием компьютерной программы Vector NTI транслировались в аминокислотные последовательности, после чего проводили филогенетический анализ. Для построения филогенетического древа использовался метод «ближайших соседей» (neighbor-joining, Кимура 2-параметр) с использованием программы MEGA v.2.1. В качестве контрольных последовательностей использовались последовательности прототипного низкодивергентного LMP1-B95-8 и высокотуморогенного LMP1-Cao, полученные из открытых баз данных PubMed и GenBank. Статистический анализ Точный тест Фишера был использован для сравнения достоверности различий между процентным содержанием вариантов LMP1 в биологических образцах двух сравниваемых групп. Значения p менее 0,05 (p < 0,05) указывало на наличие существенных различий. Результаты и обсуждение Тестирование образцов крови и смывов ротоглотки на присутствие ДНК вируса Эпштейна-Барр, проведенное при предварительном исследовании, показало, что у представителей коренного населения (нанайцев), и у иммигрантов, инфицированность ВЭБ составила 100%. Филогенетический анализ Используя экстрагированную ДНК ВЭБ, нами проведена амплификация и секвенирование образцов C-терминальной области онкогена LMP1. Анализ нуклеотидных и транслированных аминокислотных последовательностей полученных ампликонов выявил их некоторую вариабельность. Филогенетический анализ аминокислотных последовательностей полученных образцов LMP1 позволил подтвердить их гетерогенность (рисунок 1). Ни для одной из сравниваемых групп населения не выявлено преобладание B95.8/A генотипа LMP1, доминирующего у жителей Европейской части РФ и характеризующегося низким уровнем дивергенции - 3-4-мя критическими заменами а.к. по сравнению с прототипным вариантом LMP1-B95-8. Следует также отметить, что доминирование низкодивергентной группы LMP1-B95.8A отмечено только на территории европейской части России [11], в остальных странах мира представители этой группы встречаются спорадически, а превалирующее число исследованных вариантов LMP1 относится к высокодивергентным вариантам China1, NC, Med+, Med- и ряду других [14]. В проведенном исследовании, все изучаемые варианты LMP1 ВЭБ были равномерно распределены между известными в литературе низко (B95.8/A) и высокодивергентными вариантами LMP1 Med+, Med-, China1 и NC, при этом такие варианты как China2, China3 и Alaskan отсутствовали. Классификация вариантов LMP1 ВЭБ Результаты классификации образцов LMP1 от представителей двух изучаемых групп представлены в табл. 1. Из таблицы следует, что набор вариантов LMP1 и их процентное содержание у аборигенов и иммигрантов был практически одинаковым. При этом низкодивергентный вариант B95.8 в каждой группе составил примерно ¼ часть от числа всех зарегистрированных вариантов. Процентное же содержание высокодивергентного варианта China1, соответствующего китайскому варианту Cao, для которого характерен большой спектр мутаций и выраженный трансформирующий потенциал, хотя и был несколько выше в группе иммигрантов, чем в группе нанайцев (21.4%; 6/28 против 15.8%; 3/19), различие между этими показателями оказалось статистически недостоверным (p < 0.001). Содержание других вариантов онкобелка (Med+, Med-, NC) в сравниваемых группах также разнилось незначительно и статистически недостоверно. Анализ полученных данных показал, что ни один из исследованных образцов LMP1 не содержал высоко трансформирующую Cap-подобную делецию 30 п.н., характерную для вариантов LMP1 у больных нРНГ из южных провинций Китая и стран Юго-Восточной Азии, часто встречающуюся среди здорового населения этих регионов [5]. Спектр генотипических вариантов LMP1, выявляемых у аборигенов и иммигрантов Хабаровского края, а также населения европейской части России, в сопоставлении с таковым у населения различных регионов мира, представлены в табл. 2. Из таблицы видно, что для населения стран Азии и Северной Америки характерно широкое распространение штамма ВЭБ, кодирующего высокотуморогенный вариант онкобелка Cao/China1 (82.5% и 66.0% соответственно). Эти показатели контрастируют с отсутствием указанного штамма вируса у европейцев, невысокой его встречаемостью у россиян европейской части России (9.5%), а также у аборигенов и иммигрантов Хабаровского края (15.8% и 21.4% соответственно). Широкое распространение ВЭБ с высоко туморогенным вариантом LMP-China1 среди населения южных провинций Китая и стран Юго-восточной Азии является, по-видимому, важной [18], но не единственной причиной высокого уровня заболеваемости РНГ в этих странах. Играя роль пускового фактора в возникновении этого новообразования, ВЭБ для реализации онкогенных потенций нуждается в содействии ряда дополнительных факторов, одним из которых является генетическая предрасположенность лиц к РНГ, их определённый HLA гаплотип [19, 20]. Доказанными факторами риска возникновения РНГ также являются: употребление в пищу консервированных продуктов в раннем возрасте, содержащих нитраты и нитрозамины [21], курение сигарет и профессиональное воздействие формальдегида и древесной пыли [22]. Содержание низкодивергентного и низкотуморогенного варианта LMP1 B95.8 среди населения указанных регионов (табл. 2) также существенно разнилось. Наиболее высокий процент этого варианта онкобелка зарегистрирован среди населения Европейской части России (78.9%), что коррелирует с низкой заболеваемостью РНГ в стране - 0.14% у мужчин и 0.06% у женщин от числа всех зарегистрированных солидных новообразований в 2012 г. [23]. Среди населения Европы и Северной Америки частота обнаружения низкодивергентного варианта LMP1 B95.8 была практически вдвое ниже (42% и 33% соответственно), чем у жителей Европейской части России и, примерно, до четверти ниже среди аборигенов и иммигрантов Хабаровского края (26.2% и 25.0% соответственно). Учитывая высокую этническую и национальную гетерогенность населения Европы и США, связать уровни распространенности LMP1 B95.8 в этих странах с показателями заболеваемости РНГ не представляется возможным. Интересно отметить, что варианты LMP1 China 2, China 3 и Alaskan у лиц сравниваемых групп, как и среди россиян, полностью отсутствовали. Объединённый генотип LMP1 Med, состоявший из генотипов Med+ и Med- (содержавших и не содержавших делецию 10 а.к. соответственно), встречался среди изучаемых групп населения примерно с одинаковой частотой, за исключением низкого его содержания среди населения Европейской части России. Генотип LMP1 NC, отсутствующий у населения Азиатских стран и Северной Америки, у населения Европы и обеих групп Хабаровского края был невысоким и колебался от 18% до 21.4%, и составил 10.5% у населения Европейской части России [13]. Аминокислотные замены в последовательности LMP1 ВЭБ Сравнительный анализ транслированных аминокислотных последовательностей LMP1, характерных для штаммов ВЭБ, персистирующих у представителей коренного населения (нанайцев) и иммигрантов Хабаровского края, представлен в табл. 3. Результаты анализа позволяют сделать вывод о достаточно высокой степени генетического родства анализируемых образцов LMP1, хотя обнаружены и некоторые отличия. В частности, неожиданным стало выявление образца FEn14.3, полученного от представителя коренного населения, содержащего вариант LMP1 со специфической мутацией в 212-м положении (глицин на серин, G212S), сопровождающей «Cao» делецию. Эта мутация приходится на первый сайт распознавания HOS-белков (одного из компонентов E3-лигазы, участвующего в процессинге молекулы IkB - супрессора NF-kB). В то же время абсолютно все варианты LMP1 ВЭБ из тестируемых нами образцов биологического материала имели характерную для Cao-вариантов LMP1 замену в 366-м (серин на треонин) положении. Кроме того, в ряде вариантов LMP1 из обеих анализируемых групп удалось выявить дополнительные Cao-специфические мутации, например, замену глутамина на аргинин в 334-й позиции (Q334R). Вместо типичной для Cao-варианта LMP1 ВЭБ замены в 328-м положении глутаминовой кислоты на аланин (E328A) в изученных нами образцах LMP1 мы выявили модифицированную замену в том же положении глутаминовой кислоты на глутамин (E328Q). При этом данная замена не является типичной для европейских образцов, но распространена среди анализируемых образцов LMP1 ВЭБ у населения Дальнего Востока России. Вероятно, выявление данной мутации обусловлено географической близостью эндемичного для ВЭБ региона - КНР, а также активной взаимной миграцией населения пограничных районов РФ и КНР. В образце LMP1 FEn10.3, амплифицированном из смыва ротоглотки коренного населения Хабаровского края, нами обнаружена важная замена аспарагиновой кислоты на глутаминовую в 210-м положении (D210E). Известно, что данная аминокислота необходима для связывания HOS белков, что может опосредованно привести к активации транскрипционного фактора NF-kB. Кроме того, в большинстве анализируемых последовательностей LMP1 у обеих групп выявлена замена гистидина на пролин в 358-й позиции (H358P). Указанная замена может приводить к нарушению способности этого белка связывать HOS белки. Таким образом, анализ аминокислотных последовательностей образцов LMP1 ВЭБ, полученных от коренных жителей Дальнего Востока России и иммигрантов данного региона, позволил выявить в этих образцах ряд специфических мутаций, которые, при воздействии вредных факторов окружающей среды, могут оказаться критическими для инициации канцерогенеза ВЭБ-ассоциированных новообразований. Повторяющиеся элементы в онкобелке LMP1 ВЭБ Предыдущими исследованиями показано, что C-концевой домен LMP1 различных изолятов ВЭБ содержит варьирующее число повторов 11 аа (PQDPDNTDDNG), расположенных между а.к. 253 и 306 [24-26]. Вариант LMP1 прототипного штамма ВЭБ B95.8 содержит четыре таких повтора и две вставки последовательностей 5 а.к. (PHDPL: 275-279): одна расположена между 11 а.к. повторами 2 и 3, а другая после последнего повтора (а.к.: 302-306). Вставка 5 а.к. представляет собой так называемый JAK3-сайт домена CTAR3 LMP1 (а.к.: 275-330), который предположительно связан с активацией JAK3/STAT сигнального пути [24, 25]. Для выяснения структурных особенностей образцов LMP1, полученных от аборигенов (нанайцев) и иммигрантов Хабаровского края, C-концевые домены онкобелка сравнивали по сочетаниям а.к. повторов и вставок (табл. 3). Результаты свидетельствуют о том, что процентное содержание B95-8-подобных последовательностей со вставками 5 а.к. в положении 275-300 среди образцов LMP1, происходящих от нанайцев и иммигрантов, существенно не отличается [26.3% (5/19) и 25.0% (7/28) соответственно, p > 0,05]. Различия в содержании 4 и 5-ти 11-а.к. повторов (PQDPDNTDDNG) в образцах LMP1 независимо от их происхождения были также статистически недостоверны [47.4% (9/19) у нанайцев по сравнению с 60.7%. (17/28) у иммигрантов и 21.1% (4/19) у нанайцев по сравнению с 14.3% (4/28) у иммигрантов, соответственно]. Тем не менее, в отличие от образцов онкобелка от нанайцев, в LMP1 образцах иммигрантов точечная мутация D на G встречается чаще и это различие статистически достоверно [10.5% (2/19) и 42.9% (12/28) соответственно, p < 0,05]. Анализируя полученные данные, можно предположить, что образование 11 а.к. повторов и 5 а.к. вставок может происходить в результате рекомбинационных событий, происходящих во время репликации вируса. Нельзя также исключить, что расположение указанных повторов и вставок является географической особенностью структуры LMP1 у локально персистирующих штаммов ВЭБ, и, вероятно, их наличие не играет решающей роли в биологических функциях онкобелка [27, 28]. Заключение До сих пор роль ВЭБ в возникновении патологий, ассоциированных с этим вирусом, в неэндемичных регионах остается малоизученной. В данной работе впервые показано разнообразие вариантов ВЭБ, персистирующих у коренного (нанайцы) населения и иммигрантов Хабаровского края. Выявленные генетические особенности последовательностей в вариантах LMP1 ВЭБ у нанайцев, при сравнении с таковыми у жителей европейской части РФ, позволяют предположить наличие у онкогена LMP1 штаммов вируса, персистирующих среди аборигенов, уникальных свойств. В частности, обнаруженные аминокислотные замены в 212, 328 и 366 положениях молекулы LMP1, характерные для его высокотуморогенных вариантов, могут придавать этому онкобелку агрессивные характеристики. Дальнейшие исследования свойств вариантов LMP1, уникальных для жителей Дальнего Востока РФ, вероятно, позволят нам приблизиться к пониманию механизмов канцерогенеза для неэндемичных регионов.

About the authors

Ksenia V. Smirnova

N.N. Blokhin National Medical Cancer Research Center

Email: skv.lab@yandex.ru
MD, PhD, senior researcher of the Laboratory of Viral Carcinogenesis of the Research Institute of Carcinogenesis of the N.N. Blokhin National Medical Cancer Research Center, 24, Kashirskoe shosse, 115478 Moscow, Russia 24, Kashirskoe shosse, Moscow, 115478, Russia

S. V Diduk

N.N. Blokhin National Medical Cancer Research Center

24, Kashirskoe shosse, Moscow, 115478, Russia

V. E Gurtsevitch

N.N. Blokhin National Medical Cancer Research Center

24, Kashirskoe shosse, Moscow, 115478, Russia

References

Supplementary files