Новый подход для исследования ингибиторов поли(ADP-рибоза)-полимеразы, основанный на использовании пермеабилизованных адгезированных клеток

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Ингибиторы поли(ADP-рибоза)-полимеразы (PARP) рассматриваются в качестве перспективных фармакологических агентов для лечения целого ряда заболеваний. В последнее время были выявлены разнообразные факторы и механизмы регуляции каталитической активности PARP и показано, что некоторые из них могут существенно влиять на эффективность действия ингибиторов данного фермента. В связи с этим актуальна разработка новых моделей и методов, отражающих клеточный контекст, в котором функционирует PARP. В представленной работе для исследования реакции поли(ADP-рибозил)ирования (PARилирования) предложено использовать необратимо пермеабилизованные дигитонином адгезированные клетки, что позволяет сохранить ядерную локализацию PARP и задавать необходимые концентрации субстрата (NAD+) и тестируемых соединений в клетке. Особенность подхода заключается в том, что перед пермеабилизацией клеточная PARP переводится в связанное с ДНК состояние в условиях, предотвращающих преждевременную инициацию реакции PARилирования. Исследования выполнены на культуре кардиомиобластов крысы Н9с2. Анализ активности PARP в пермеабилизованных клетках проводили путём измерения иммунофлуоресценции образующегося продукта – поли(ADP-рибозы). Метод апробирован при исследовании PARP-ингибиторного действия классического ингибитора 3-аминобензамида, а также ряда новых производных 7-метилгуанина. Обнаружено, что одно из них, 7,8-диметилгуанин, является более сильным ингибитором по сравнению с 7-метилгуанином, что объясняется дополнительным гидрофобным контактом с белком. Предложенный подход открывает новые перспективы для изучения механизмов регуляции активности PARP в клетке и может быть использован для высокопроизводительного скрининга веществ при поиске новых ингибиторов PARP.

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

С. И. Шрам

Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт»

Автор, ответственный за переписку.
Email: shram.img@yandex.ru
Россия, 123182 Москва

Т. А. Щербакова

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского

Email: shram.img@yandex.ru
Россия, 119992 Москва

Т. В. Абрамова

Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения РАН

Email: shram.img@yandex.ru
Россия, 630090 Новосибирск

М. С. Смирновская

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Email: shram.img@yandex.ru

химический факультет

Россия, 119991 Москва

А. И. Баландина

Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт»; Российский химико-технологический университет имени Д.И. Менделеева

Email: shram.img@yandex.ru

факультет биотехнологии и промышленной экологии

Россия, 123182 Москва; 125047 Москва

А. В. Куликов

Российский университет дружбы народов имени Патриса Лумумбы

Email: shram.img@yandex.ru

Медицинский институт

Россия, 117198 Москва

В. К. Швядас

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского; Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Email: shram.img@yandex.ru

факультет биоинженерии и биоинформатики

Россия, 119992 Москва; 119234 Москва

В. Н. Сильников

Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения РАН

Email: shram.img@yandex.ru
Россия, 630090 Новосибирск

Н. Ф. Мясоедов

Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт»

Email: shram.img@yandex.ru
Россия, 123182 Москва

Д. К. Нилов

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского

Email: shram.img@yandex.ru
Россия, 119992 Москва

Список литературы

  1. Hassa, P. O., Haenni, S. S., Elser, M., and Hottiger, M. O. (2006) Nuclear ADP-ribosylation reactions in mammalian cells: where are we today and where are we going? Microbiol. Mol. Biol. Rev., 70, 789-829, https://doi.org/10.1128/MMBR.00040-05.
  2. Шиловский Г. А., Хохлов А. Н., Шрам С. И. (2013) Cистема поли(ADP-рибозил)ирования белков: роль в поддержании стабильности генома и детерминации продолжительности жизни, Биохимия, 78, 473-487.
  3. Gupte, R., Liu, Z., and Kraus, W. L. (2017) PARPs and ADP-ribosylation: recent advances linking molecular functions to biological outcomes, Genes Dev., 31, 101-126, https://doi.org/10.1101/gad.291518.116.
  4. Kamaletdinova, T., Fanaei-Kahrani, Z., and Wang, Z. Q. (2019) The enigmatic function of PARP1: from PARylation activity to PAR readers, Cells, 8, 1625, https://doi.org/10.3390/cells8121625.
  5. Alemasova, E. E., and Lavrik, O. I. (2019) Poly(ADP-ribosyl)ation by PARP1: reaction mechanism and regulatory proteins, Nucleic Acids Res., 47, 3811-3827, https://doi.org/10.1093/nar/gkz120.
  6. Нилов Д. К., Пушкарев С. В., Гущина И. В., Манасарян Г. А., Кирсанов К. И., Швядас В. К. (2020) Моделирование фермент-субстратных комплексов поли(ADP-рибозо)полимеразы 1 человека, Биохимия, 85, 116-125, https://doi.org/10.31857/S0320972520010091.
  7. Jungmichel, S., Rosenthal, F., Altmeyer, M., Lukas, J., Hottiger, M. O., and Nielsen, M. L. (2013) Proteome-wide identification of poly(ADP-ribosyl)ation targets in different genotoxic stress responses, Mol. Cell, 52, 272-285, https://doi.org/10.1016/j.molcel.2013.08.026.
  8. Hoch, N. C., and Polo, L. M. (2019) ADP-ribosylation: from molecular mechanisms to human disease, Genet. Mol. Biol., 43, e20190075, https://doi.org/10.1590/1678-4685-GMB-2019-0075.
  9. Manasaryan, G., Suplatov, D., Pushkarev, S., Drobot, V., Kuimov, A., Švedas, V., and Nilov, D. (2021) Bioinformatic analysis of the nicotinamide binding site in poly(ADP-ribose) polymerase family proteins, Cancers (Basel), 13, 1201, https://doi.org/10.3390/cancers13061201.
  10. Lavrik, O. I. (2020) PARPs’ impact on base excision DNA repair, DNA Repair (Amst.), 93, 102911, https://doi.org/ 10.1016/j.dnarep.2020.102911.
  11. Gibson, B. A., and Kraus, W. L. (2012) New insights into the molecular and cellular functions of poly(ADP-ribose) and PARPs, Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 13, 411-424, https://doi.org/10.1038/nrm3376.
  12. Grimaldi, G., and Corda, D. (2019) ADP-ribosylation and intracellular traffic: an emerging role for PARP enzymes, Biochem. Soc. Trans., 47, 357-370, https://doi.org/10.1042/BST20180416.
  13. Van Wijk, S. J., and Hageman, G. J. (2005) Poly(ADP-ribose) polymerase-1 mediated caspase-independent cell death after ischemia/reperfusion, Free Radic. Biol. Med., 39, 81-90, https://doi.org/10.1016/j.freeradbiomed.2005.03.021.
  14. Virág, L., Robaszkiewicz, A., Rodriguez-Vargas, J. M., and Oliver, F. J. (2013) Poly(ADP-ribose) signaling in cell death, Mol. Aspects Med., 34, 1153-1167, https://doi.org/10.1016/j.mam.2013.01.007.
  15. Liu, S., Luo, W., and Wang, Y. (2022) Emerging role of PARP-1 and PARthanatos in ischemic stroke, J. Neurochem., 160, 74-87, https://doi.org/10.1111/jnc.15464.
  16. Pacher, P., and Szabó, C. (2007) Role of poly(ADP-ribose) polymerase 1 (PARP-1) in cardiovascular diseases: the therapeutic potential of PARP inhibitors, Cardiovasc. Drug Rev., 25, 235-260, https://doi.org/10.1111/ j.1527-3466.2007.00018.x.
  17. Narne, P., Pandey, V., Simhadri, P. K., and Phanithi, P. B. (2017) Poly(ADP-ribose)polymerase-1 hyperactivation in neurodegenerative diseases: the death knell tolls for neurons, Semin. Cell Dev. Biol., 63, 154-166, https:// doi.org/10.1016/j.semcdb.2016.11.007.
  18. Berger, N. A., Besson, V. C., Boulares, A. H., Bürkle, A., Chiarugi, A., Clark, R. S., Curtin, N. J., Cuzzocrea, S., Dawson, T. M., Dawson, V. L., Haskó, G., Liaudet, L., Moroni, F., Pacher, P., Radermacher, P., Salzman, A. L., Snyder, S. H., Soriano, F. G., Strosznajder, R. P., Sümegi, B., Swanson, R. A., and Szabo, C. (2018) Opportunities for the repurposing of PARP inhibitors for the therapy of non-oncological diseases, Br. J. Pharmacol., 175, 192-222, https://doi.org/10.1111/bph.13748.
  19. Ke, Y., Wang, C., Zhang, J., Zhong, X., Wang, R., Zeng, X., and Ba, X. (2019) The role of PARPs in inflammation-and metabolic-related diseases: molecular mechanisms and beyond, Cells, 8, 1047, https://doi.org/10.3390/cells8091047.
  20. Rose, M., Burgess, J. T., O’Byrne, K., Richard, D. J., and Bolderson, E. (2020) PARP inhibitors: clinical relevance, mechanisms of action and tumor resistance, Front. Cell Dev. Biol., 8, 564601, https://doi.org/10.3389/fcell.2020.564601.
  21. Slade, D. (2020) PARP and PARG inhibitors in cancer treatment, Genes Dev., 34, 360-394, https://doi.org/10.1101/gad.334516.119.
  22. Bruin, M. A. C., Sonke, G. S., and Beijnen, J. H. (2022) Pharmacokinetics and pharmacodynamics of PARP inhibitors in oncology, Clin. Pharmacokinet., 61, 1649-1675, https://doi.org/10.1007/s40262-022-01167-6.
  23. Flippot, R., Patrikidou, A., Aldea, M., Colomba, E., Lavaud, P., Albigès, L., Naoun, N., Blanchard, P., Terlizzi, M., Garcia, C., Bernard-Tessier, A., Fuerea, A., Di Palma, M., Escudier, B., Loriot, Y., Baciarello, G., and Fizazi, K. (2022) PARP inhibition, a new therapeutic avenue in patients with prostate cancer, Drugs, 82, 719-733, https://doi.org/10.1007/s40265-022-01703-5.
  24. Kurgina, T. A., Moor, N. A., Kutuzov, M. M., Naumenko, K. N., Ukraintsev, A. A., and Lavrik, O. I. (2021) Dual function of HPF1 in the modulation of PARP1 and PARP2 activities, Commun. Biol., 4, 1259, https://doi.org/10.1038/s42003-021-02780-0.
  25. Piao, L., Fujioka, K., Nakakido, M., and Hamamoto, R. (2018) Regulation of poly(ADP-ribose) polymerase 1 functions by post-translational modifications, Front. Biosci. (Landmark Ed.), 23, 13-26, https://doi.org/10.2741/4578.
  26. Grube, K., Küpper, J. H., and Bürkle, A. (1991) Direct stimulation of poly(ADP ribose) polymerase in permeabilized cells by double-stranded DNA oligomers, Anal. Biochem., 193, 236-239, https://doi.org/10.1016/ 0003-2697(91)90015-l.
  27. Шрам С. И., Шиловский Г. А., Хохлов А. Н. (2006) Поли(АДФ-рибоза)-полимераза-1 и старение: изучение возможной связи в экспериментах на стационарных клеточных культурах, Бюлл. эксп. биол. и мед., 141, 567-571.
  28. Althaus, F. R., Lawrence, S. D., Sattler, G. L., and Pitot, H. C. (1982) ADP-ribosyltransferase activity in cultured hepatocytes. Interactions with DNA repair, J. Biol. Chem., 257, 5528-5535, https://doi.org/10.1016/S0021-9258(19)83809-7.
  29. Muiras, M. L., Müller, M., Schächter, F., and Bürkle, A. (1998) Increased poly(ADP-ribose) polymerase activity in lymphoblastoid cell lines from centenarians, J. Mol. Med. (Berl.), 76, 346-354, https://doi.org/10.1007/s001090050226.
  30. Nilov, D., Maluchenko, N., Kurgina, T., Pushkarev, S., Lys, A., Kutuzov, M., Gerasimova, N., Feofanov, A., Švedas, V., Lavrik, O., and Studitsky, V. M. (2020) Molecular mechanisms of PARP-1 inhibitor 7-methylguanine, Int. J. Mol. Sci., 21, 2159, https://doi.org/10.3390/ijms21062159.
  31. Кургина Т. А., Шрам С. И., Кутузов М. М., Абрамова Т. В., Щербакова Т. А., Мальцева Е. А., Поройков В. В., Лаврик О. И., Швядас В. К., Нилов Д. К. (2022) Ингибиторное действие 7-метилгуанина и его метаболита 8-гидрокси-7-метилгуанина на поли(ADP-рибозо)полимеразу 1 человека, Биохимия, 87, 794-803, https://X/10.31857/S0320972522060070.
  32. Kirsanov, K., Fetisov, T., Antoshina, E., Trukhanova, L., Gor’kova, T., Vlasova, O., Khitrovo, I., Lesovaya, E., Kulbachevskaya, N., Shcherbakova, T., Belitsky, G., Yakubovskaya, M., Švedas, V., and Nilov, D. (2022) Toxicological properties of 7-methylguanine, and preliminary data on its anticancer activity, Front. Pharmacol., 13, 842316, https://doi.org/10.3389/fphar.2022.842316.
  33. Шрам С. И., Щербакова Т. А., Абрамова Т. В., Барадиева Э. Ц., Ефремова А. С., Смирновская М. С., Сильников В. Н., Швядас В. К., Нилов Д. К. (2023) Природные производные гуанина оказывают PARP-ингибиторное и цитопротекторное действие на модели повреждения кардиомиоцитов при окислительном стрессе, Биохимия, 88, 962-972, https://doi.org/10.31857/S0320972523060064.
  34. Gushchina, I. V., Polenova, A. M., Suplatov, D. A., Švedas, V. K., and Nilov, D. K. (2020) vsFilt: a tool to improve virtual screening by structural filtration of docking poses, J. Chem. Inf. Model., 60, 3692-3696, https://doi.org/10.1021/acs.jcim.0c00303.
  35. Stroganov, O. V., Novikov, F. N., Stroylov, V. S., Kulkov, V., and Chilov, G. G. (2008) Lead finder: an approach to improve accuracy of protein-ligand docking, binding energy estimation, and virtual screening, J. Chem. Inf. Model., 48, 2371-2385, https://doi.org/10.1021/ci800166p.
  36. Novikov, F. N., Stroylov, V. S., Zeifman, A. A., Stroganov, O. V., Kulkov, V., and Chilov, G. G. (2012) Lead Finder docking and virtual screening evaluation with Astex and DUD test sets, J. Comput. Aided Mol. Des., 26, 725-735, https://doi.org/10.1007/s10822-012-9549-y.
  37. Humphrey, W., Dalke, A., and Schulten, K. (1996) VMD: Visual molecular dynamics, J. Mol. Graph., 14, 33-38, https://doi.org/10.1016/0263-7855(96)00018-5.
  38. Fiskum, G., Craig, S. W., Decker, G. L., and Lehninger, A. L. (1980) The cytoskeleton of digitonin-treated rat hepatocytes, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 3430-3434, https://doi.org/10.1073/pnas.77.6.3430.
  39. Schulz, I. (1990) Permeabilizing cells: some methods and applications for the study of intracellular processes, Methods Enzymol., 192, 280-300, https://doi.org/10.1016/0076-6879(90)92077-q.
  40. Esparís-Ogando, A., Zurzolo, C., and Rodriguez-Boulan, E. (1994) Permeabilization of MDCK cells with cholesterol binding agents: dependence on substratum and confluency, Am. J. Physiol., 267, C166-C176, https://doi.org/ 10.1152/ajpcell.1994.267.1.C166.
  41. Sudji, I. R., Subburaj, Y., Frenkel, N., García-Sáez, A. J., and Wink, M. (2015) Membrane disintegration caused by the steroid saponin digitonin is related to the presence of cholesterol, Molecules, 20, 20146-20160, https://doi.org/10.3390/molecules201119682.
  42. Adam, S. A., Marr, R. S., and Gerace, L. (1990) Nuclear protein import in permeabilized mammalian cells requires soluble cytoplasmic factors, J. Cell Biol., 111, 807-816, https://doi.org/10.1083/jcb.111.3.807.
  43. Langelier, M. F., Zandarashvili, L., Aguiar, P. M., Black, B. E., and Pascal, J. M. (2018) NAD+ analog reveals PARP-1 substrate-blocking mechanism and allosteric communication from catalytic center to DNA-binding domains, Nat. Commun., 9, 844, https://doi.org/10.1038/s41467-018-03234-8.
  44. Clark, N. J., Kramer, M., Muthurajan, U. M., and Luger, K. (2012) Alternative modes of binding of poly(ADP-ribose) polymerase 1 to free DNA and nucleosomes, J. Biol. Chem., 287, 32430-32439, https://doi.org/10.1074/ jbc.M112.397067.
  45. Sukhanova, M. V., Abrakhi, S., Joshi, V., Pastre, D., Kutuzov, M. M., Anarbaev, R. O., Curmi, P. A., Hamon, L., and Lavrik, O. I. (2015) Single molecule detection of PARP1 and PARP2 interaction with DNA strand breaks and their poly(ADP-ribosyl)ation using high-resolution AFM imaging, Nucleic Acids Res., 44, e60, https://doi.org/10.1093/nar/gkv1476.
  46. Riccio, A. A., Cingolani, G., and Pascal, J. M. (2016) PARP-2 domain requirements for DNA damage-dependent activation and localization to sites of DNA damage, Nucleic Acids Res., 44, 1691-1702, https://doi.org/10.1093/ nar/gkv1376.
  47. Kutuzov, M. M., Belousova, E. A., Kurgina, T. A., Ukraintsev, A. A., Vasil’eva, I. A., Khodyreva, S. N., and Lavrik, O. I. (2021) The contribution of PARP1, PARP2 and poly(ADP-ribosyl)ation to base excision repair in the nucleosomal context, Sci. Rep., 11, 4849, https://doi.org/10.1038/s41598-021-84351-1.
  48. Kim, M. Y., Mauro, S., Gévry, N., Lis, J. T., and Kraus, W. L. (2004) NAD+-dependent modulation of chromatin structure and transcription by nucleosome binding properties of PARP-1, Cell, 119, 803-814, https://doi.org/10.1016/ j.cell.2004.11.002.
  49. Palazzo, L., Suskiewicz, M. J., and Ahel, I. (2021) Serine ADP-ribosylation in DNA-damage response regulation, Curr. Opin. Genet. Dev., 71, 106-113, https://doi.org/10.1016/j.gde.2021.07.005.
  50. Алемасова Е. Э., Науменко К. Н., Суханова М. В., Лаврик О. И. (2022) Роль YB-1 в регуляции процесса поли(АДФ-рибозил)ирования, катализируемого поли(АДФ-рибоза)полимеразами, Усп. Биол. Хим., 62, 63-98.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Пермеабилизация клеток Н9с2 дигитонином. а–в – Гипотонический раствор без дигитонина. г–е – Гипотонический раствор с дигитонином (35 мкМ). Ядра пермеабилизованных клеток окрашены гомодимером этидия III (а, в, г, е). Длина масштабной планки соответствует 100 мкм. Объектив 10×

Скачать (257KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Влияние предварительной обработки клеток PJ34 и H2O2 на активность PARP в пермеабилизованных дигитонином клетках Н9с2. а–з – Микрофлуоресцентный анализ содержания PAR в ядрах клеток (1–4 – различные варианты анализируемых препаратов). Длина масштабной планки соответствует 50 мкм. Объектив 20×. и – Результаты количественного анализа PAR в отдельных ядрах. Число проанализированных ядер: 198 (1), 236 (2), 229 (3), 144 (4). Средние и медианные значения отражены синей и красной линиями соответственно. к – Варьирование значений уровня PAR при анализе отдельных микрофлуоресцентных снимков разных препаратов (среднее ± стандартное отклонение; n = 6). Концентрации реагентов: PJ34 – 5 мкМ, H2O2 – 1 мМ, дигитонин – 35 мкМ, олиго-ДНК – 50 мкг/мл, NAD+ – 10 мкМ; время инкубации с H2O2 – 5 мин; время инкубации с NAD+ – 5 мин. *** p < 0,001 между всеми парами образцов (дисперсионный анализ ANOVA/апостериорный анализ Бонферрони)

Скачать (421KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Оптимизированная схема анализа активности PARP в пермеабилизованных адгезированных клетках. 1 – Адгезированные интактные клетки; 2 – преинкубация с PJ34 (5 мкМ, 1 ч, 37 °С, 5% СО2); 3 – обработка Н2О2 (1 мМ, 5 мин, 25 °С); 4 – образование комплекса PARP–ДНК; 5 – пермеабилизация дигитонином (35 мкМ, 5 мин, 0 °С); 6 – отмывка от дигитонина, PJ34 и эндогенного NAD+; 7 – инкубация пермеабилизованных клеток с экзогенным NAD+ (10 мкМ) и тестируемым соединением (2–10 мин, 25 °С); 8 – PARилирование белков

Скачать (478KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Химические структуры 7-метилгуанина и его производных

Скачать (120KB)
Метаданные
6. Рис. 5. Концентрационные зависимости ингибирования PARP тестируемыми соединениями в пермеабилизованных клетках Н9с2. Обозначения: 1 – 3-аминобензамид; 2 – 7-метилгуанин; 3 – 7,8-диметилгуанин; 4 – N2,7-диметилгуанин. Условия: NAD+ – 10 мкМ; время инкубации – 10 мин; концентрации 3-аминобензамида и 7,8-диметилгуанина – 0,2, 1, 2,5, 5, 10, 25, 50, 100 мкМ; концентрации 7-метилгуанина и N2,7-диметилгуанина – 10, 25, 75, 100, 150, 200, 250, 400 мкМ

Скачать (91KB)
Метаданные
7. Рис. 6. Моделирование связывания ингибиторов в активном центре PARP1. а – 3-Аминобензамид; б – 7-метилгуанин; в – 7,8-диметилгуанин; г – N2,7-диметилгуанин. Неполярные атомы водорода аминокислотных остатков не показаны. Пунктирными линиями обозначены ключевые водородные связи с Gly863

Скачать (338KB)
Метаданные
8. Прил.
Скачать (705KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2024