Влияние нуклеотидного контекста на протекание неспецифической амплификации ДНК под действием ДНК-полимеразы Bst exo-

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

В последние годы всё большее распространение приобретают методы амплификации нуклеиновых кислот, протекающие в изотермическом режиме и требующие использования ДНК-полимераз с цепь-вытесняющей активностью. Среди таковых наиболее популярной является полимераза Bst exo-, однако она склонна вести неспецифический синтез ДНК посредством мультимеризации. В данной работе показано влияние нуклеотидной последовательности на прочность связывания Bst exo- с ДНК и на эффективность запуска мультимеризации. На моделях одноцепочечных тринуклеотидов (sst) и динуклеотидных дуплексов (dst) методом молекулярного докинга выявлена предпочтительность связывания «закрытой» формы Bst exo- с пурин-богатыми последовательностями, особенно содержащими dG на 3′-конце растущей цепи. Данные, полученные in silico, подтверждены в экспериментах с использованием олигонуклеотидных матриц, различающихся структурой 3′- и 5′-концевых мотивов. Показано, что матрицы с олигопуриновым 3′-концевым фрагментом и олигопиримидиновой 5′-концевой частью способствуют более раннему запуску мультимеризации. Полученные данные могут быть использованы на этапе выбора оптимальных нуклеотидных последовательностей для изотермической амплификации, обеспечивающих получение более достоверных результатов. Так, для исключения мультимеризации следует избегать ДНК-матриц и праймеров, содержащих концевые нуклеотиды dA и/или dG.

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

Р. Р. Гарафутдинов

Уфимский федеральный исследовательский центр Российской академии наук

Email: garafutdinovr@gmail.com

Институт биохимии и генетики 

Россия, 450054 Уфа, Башкортостан

О. Ю. Купова

Уфимский федеральный исследовательский центр Российской академии наук

Email: garafutdinovr@gmail.com

Институт биохимии и генетики

Россия, 450054 Уфа, Башкортостан

А. Р. Сахабутдинова

Уфимский федеральный исследовательский центр Российской академии наук

Автор, ответственный за переписку.
Email: garafutdinovr@gmail.com

Институт биохимии и генетики 

Россия, 450054 Уфа, Башкортостан

Список литературы

  1. Бодулев О. Л., Сахаров И. Ю. (2020) Изотермические методы амплификации нуклеиновых кислот и их применение в биоанализе, Биохимия, 85, 174-196, doi: 10.31857/S0320972520020037.
  2. Soroka, M., Wasowicz, B., and Rymaszewska, A. (2021) Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): the better sibling of PCR? Cells, 10, 1931, doi: 10.3390/cells10081931.
  3. Гарафутдинов Р. Р., Сахабутдинова А. Р., Гильванов А. Р., Чемерис А. В. (2021) Амлификация нуклеиновых кислот «катящимся кольцом» – универсальный метод анализа широкого круга биологических мишеней, Биоорг. Химия, 47, 721-740, doi: 10.31857/S0132342321060075.
  4. Kuznetsova, A. A., Fedorova, O. S., and Kuznetsov, N. A. (2022) Structural and molecular kinetic features of activities of DNA polymerases, Int. J. Mol. Sci., 23, 6373, doi: 10.3390/ijms23126373.
  5. Oscorbin, I., and Filipenko, M. (2023) Bst polymerase – a humble relative of Taq polymerase, Comput. Struct. Biotechnol. J., 21, 4519-4535, doi: 10.1016/j.csbj.2023.09.008.
  6. Hafner, G. J., Yang, I. C., Wolter, L. C., Stafford, M. R., and Giffard, P. M. (2001) Isothermal amplification and multimerization of DNA by Bst DNA polymerase, BioTechniques, 30, 852-886, doi: 10.2144/01304rr03.
  7. Garafutdinov, R. R., Gilvanov, A. R., and Sakhabutdinova, A. R. (2020) The influence of reaction conditions on DNA multimerization during isothermal amplification with Bst DNA polymerase, Appl. Biochem. Biotechnol., 190, 758-771, doi: 10.1007/s12010-019-03127-6.
  8. Wang, G., Ding, X., Hu, J., Wu, W., Sun, J., and Mu, Y. (2017) Unusual isothermal multimerization and amplification by the strand-displacing DNA polymerases with reverse transcription activities, Sci. Rep., 7, 13928, doi: 10.1038/s41598-017-13324-0.
  9. Sakhabutdinova, A. R., Kamalov, M. I., Salakhieva, D. V., Mavzyutov, A. R., and Garafutdinov, R. R. (2021) Inhibition of nonspecific polymerase activity using poly(aspartic) acid as a model anionic polyelectrolyte, Anal. Biochem., 628, 114267, doi: 10.1016/j.ab.2021.114267.
  10. Зырина Н. В., Антипова В. Н. (2021) Неспецифический синтез нуклеиновых кислот в реакциях изотермической амплификации, Биохимия, 86, 1066-1077, doi: 10.31857/S0320972521070101.
  11. Rolando, J. C., Jue, E., Barlow, J. T., and Ismagilov, R. F. (2020) Real-time kinetics and high-resolution melt curves in single-molecule digital LAMP to differentiate and study specific and non-specific amplification, Nucleic Acids Res., 48, e42, doi: 10.1093/nar/gkaa099.
  12. Reid, M. S., Le, X. C., and Zhang, H. (2018) Exponential isothermal amplification of nucleic acids and assays for proteins, cells, small molecules, and enzyme activities: an EXPAR example, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 57, 11856-11866, doi: 10.1002/anie.201712217.
  13. Tan, E., Erwin, B., Dames, S., Ferguson, T., Buechel, M., Irvine, B., Voelkerding, K., and Niemz, A. (2008) Specific versus nonspecific isothermal DNA amplification through thermophilic polymerase and nicking enzyme activities, Biochemistry, 47, 9987-9999, doi: 10.1021/bi800746p.
  14. Qian, J., Ferguson, T. M., Shinde, D. N., Ramírez-Borrero, A. J., Hintze, A., Adami, C., and Niemz, A. (2012) Sequence dependence of isothermal DNA amplification via EXPAR, Nucleic Acids Res., 40, e87, doi: 10.1093/nar/gks230.
  15. Garafutdinov, R. R., Sakhabutdinova, A. R., Kupryushkin, M. S., and Pyshnyi, D. V. (2020) Prevention of DNA multimerization during isothermal amplification with Bst exo–DNA polymerase, Biochimie, 168, 259-267, doi: 10.1016/ j.biochi.2019.11.013.
  16. Сахабутдинова А. Р., Мирсаева Л. Р., Оскорбин И. П., Филипенко М. Л., Гарафутдинов Р. Р. (2020) Устранение мультимеризации ДНК, возникающей при изотермической амплификации в присутствии ДНК полимеразы Bst exo-, Биоорг. Химия, 46, 56-64, doi: 10.31857/S0132342320010091.
  17. Garafutdinov, R. R., Gilvanov, A. R., Kupova, O. Y., and Sakhabutdinova, A. R. (2020) Effect of metal ions on isothermal amplification with Bst exo– DNA polymerase, Int. J. Biol. Macromol., 161, 1447-1455, doi: 10.1016/ j.ijbiomac.2020.08.028.
  18. Schrödinger Suite, Small-Molecule Drug Discovery Suite 2016-4, Schrödinger, LLC, New York, 2016.
  19. Garafutdinov, R. R., Kupova, O. Y., and Sakhabutdinova, A. R. (2020) Data on molecular docking simulations of quaternary complexes ‘Bst exo– polymerase-DNA-dCTP-metal cations’, Data-in-Brief, 33, 106549, doi: 10.1016/j.dib.2020.106549.
  20. Protein Preparation Wizard; Epik, Schrödinger, LLC, New York, NY, 2016; Impact, Schrödinger, LLC, New York, NY, 2016; Prime, Schrödinger, LLC, New York, NY, 2016.
  21. Sastry, G. M., Adzhigirey, M., Day, T., Annabhimoju, R., and Sherman, W. (2013) Protein and ligand preparation: parameters, protocols, and influence on virtual screening enrichments, J. Comput. Aid. Mol. Des., 27, 221-234, doi: 10.1007/s10822-013-9644-8.
  22. Wu, E. Y., and Beese, L. S. (2011) The structure of a high fidelity DNA polymerase bound to a mismatched nucleotide reveals an “ajar” intermediate conformation in the nucleotide selection mechanism, J. Biol. Chem., 286, 19758-19767, doi: 10.1074/jbc.M110.191130.
  23. Knorre, D. G., Lavrik, O. I., and Nevinsky, G. A. (1988) Protein-nucleic acid interaction in reactions catalyzed with DNA polymerases, Biochimie, 70, 655-661, doi: 10.1016/0300-9084(88)90250-7.
  24. Kolocheva, T. I., Nevinsky, G. A., Levina, A. S., Khomov, V. V., and Lavrik, O. I. (1991) The mechanism of recognition of templates by DNA polymerases from pro- and eukaryotes as revealed by affinity modification data, J. Biomol. Struct. Dyn., 9, 169-186, doi: 10.1080/07391102.1991.10507901.
  25. Doronin, S. V., Nevinsky, G. A., Malygina, T. O., Podust, V. N., Khomov, V. V., and Lavrik, O. I. (1989) The efficiency of interaction of deoxyribonucleoside-5’-mono-, di- and triphosphates with the active center of E. coli DNA polymerase I Klenow fragment, FEBS Lett., 259, 83-85, doi: 10.1016/0014-5793(89)81500-5.
  26. Kolocheva, T. I., Nevinsky, G. A., Volchkova, V. A., Levina, A. S., Khomov, V. V., and Lavrik, O. I. (1989) DNA polymerase I (Klenow fragment): role of the structure and length of a template in enzyme recognition, FEBS Lett., 248, 97-100, doi: 10.1016/0014-5793(89)80439-9.
  27. Garafutdinov, R. R., Burkhanova, G. F., Maksimov, I. V., Sakhabutdinova, A. R. (2023) New method for microRNA detection based on multimerization, Anal. Biochem., 664, 115049, doi: 10.1016/j.ab.2023.115049.
  28. Сахабутдинова А. Р., Чемерис А. В., Гарафутдинов Р. Р. (2023) Обнаружение специфических РНК-мишеней с помощью мультимеризации, Биохимия, 88, 832-840, doi: 10.31857/S032097252305010X.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Структура модельных одноцепочечных тринуклеотидов (sst) и динуклеотидных дуплексов (dst)

Скачать (52KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Усреднённые значения docking score, полученные при рассмотрении только нуклеотидов N2 и N3 (звёздочкой отмечены динуклеотиды, соответствующие наиболее прочным комплексам)

Скачать (466KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Диаграмма взаимодействия лигандов на примере комплекса Bst exo- с dst (в качестве примера приведён тринуклеотид 5′-САС-3′). В виде сфер представлены а/к: фиолетовые сферы – а/к, несущие положительно заряженные группы, голубые – содержащие полярные группы, зелёные – гидрофобные, красные – несущие отрицательно заряженные группы; цветными линиями и стрелками показаны химические взаимодействия между а/к и окружением: красные стрелки – ионные связи (солевые мостики, sb), синие – водородные связи (Н), отсутствие стрелок – прочие слабые взаимодействия (+)

Скачать (320KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Схема протекания мультимеризации: отжиг и удлинение праймера R на ДНК-матрице I, приводящие к образованию двуцепочечного продукта длиной 1L (этап 1), образование псевдоциклической ДНК-структуры Ini (этап 2), элонгация цепей в Ini, формирование двуцепочечного продукта длиной 2L (этапы 3, 4 и 5б) или отжиг и элонгация праймера R (этапы 3, 4 и 5а), образование матрицы II (этап 5а), вытеснение ДНК-матрицы II и отжиг на ней праймера F (этап 6), формирование полноразмерных ампликонов с тандемными нуклеотидными последовательностями (этапы i). Праймер F и комплементарные ему участки показаны чёрным цветом, праймер R и комплементарные ему участки – серым

Скачать (167KB)
Метаданные
6. Рис. 5. Накопление продуктов мультимеризации для матриц с различающейся первичной структурой концевых фрагментов (приведены данные, полученные при использовании буфера Taq). Вставка: электрофоретическое разделение мультимеров: 1 – матрица ЛМ1, 2 – ЛМ2, 3 – ЛМ3, 4 – ЛМ4, 5 – ЛМ5, 6 – ЛМ6, М – маркер 50 bp DNA ladder

Скачать (215KB)
Метаданные
7. Приложение 1
Скачать (57KB)
Метаданные
8. Приложение 2
Скачать (25KB)
Метаданные
9. Приложение 3
Скачать (68KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2024