Ассоциированный с фосфатазой CD45 лимфоцитарный фосфопротеин LPAP регулирует её стабильность

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Ассоциированный с фосфатазой лимфоцитарный фосфопротеин (LPAP) является белком-партнёром фосфатазы CD45, однако его функция до сих пор мало изучена. Образование прочного комплекса между LPAP и CD45 позволяет предположить, что LPAP способен регулировать CD45, однако прямых биохимических подтверждений этому до сих пор не получено. Мы обнаружили, что на лимфоидных клетках Jurkat уровни белков LPAP и CD45 взаимосвязаны и коррелируют между собой. Нокаут LPAP приводит к снижению, а повышение его уровня, напротив, вызывает увеличение количества поверхностного CD45. На нелимфоидных клетках K562 такой корреляции не обнаруживалось. Мы предполагаем, что LPAP регулирует стабильность фосфатазы CD45, что, в свою очередь, способно влиять на процессы активации лимфоцитов.

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

Н. А. Круглова

ФГБУН Институт биологии гена РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: natalya.a.kruglova@yandex.ru

Центр высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины

Россия, 119334, Москва

Д. В. Мазуров

ГНЦ «Институт иммунологии» ФМБА России

Email: natalya.a.kruglova@yandex.ru
Россия, 115522, Москва

А. В. Филатов

ГНЦ «Институт иммунологии» ФМБА России; Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Email: avfilat@yandex.ru

биологический факультет, кафедра иммунологии

Россия, 115522, Москва; 119234, Москва

Список литературы

  1. Schraven, B., Schoenhaut, D., Bruyns, E., Koretzky, G., Eckerskorn, C., et al. (1994) LPAP, a novel 32-kDa phosphoprotein that interacts with CD45 in human lymphocytes, J. Biol. Chem., 269, 29102-29111.
  2. Rheinländer, A., Schraven, B., and Bommhardt, U. (2018) CD45 in human physiology and clinical medicine, Immunol. Lett., 196, 22-32, https://doi.org/10.1016/j.imlet.2018.01.009.
  3. Kleiman, E., Salyakina, D., De Heusch, M., Hoek, K. L., Llanes, J. M., et al. (2015) Distinct transcriptomic features are associated with transitional and mature B-cell populations in the mouse spleen, Front. Immunol., 6, 30, https:// doi.org/10.3389/fimmu.2015.00030.
  4. Kruglova, N. A., Meshkova, T. D., Kopylov, A. T., Mazurov, D. V., and Filatov, A. V. (2017) Constitutive and activation-dependent phosphorylation of lymphocyte phosphatase-associated phosphoprotein (LPAP), PLoS One, 12, e0182468, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0182468.
  5. Kruglova, N., Filatov, A. (2019) T cell receptor signaling results in ERK-dependent Ser163 phosphorylation of lymphocyte phosphatase-associated phosphoprotein, Biochem. Biophys. Res. Commun., 519, 559-565, https://doi.org/ 10.1016/j.bbrc.2019.09.041.
  6. Takeda, A., Matsuda, A., Paul, R. M. J., and Yaseen, N. R. (2004) CD45-associated protein inhibits CD45 dimerization and up-regulates its protein tyrosine phosphatase activity, Blood, 103, 3440-3447, https://doi.org/10.1182/blood-2003-06-2083.
  7. Schraven, B., Kirchgessner, H., Gaber, B., Samstag, Y., and Meuer, S. (1991) A functional complex is formed in human T lymphocytes between the protein tyrosine phosphatase CD45, the protein tyrosine kinase p56lck and pp32, a possible common substrate, Eur. J. Immunol., 21, 2469-2477, https://doi.org/10.1002/eji.1830211025.
  8. Filatov, A., Kruglova, N., Meshkova, T., and Mazurov, D. (2015) Lymphocyte phosphatase-associated phosphoprotein proteoforms analyzed using monoclonal antibodies, Clin. Transl. Immunol., 4, e44, https://doi.org/10.1038/cti.2015.22.
  9. Ding, I., Bruyns, E., Li, P., Magada, D., Paskind, M., et al. (1999) Biochemical and functional analysis of mice deficient in expression of the CD45-associated phosphoprotein LPAP, Eur. J. Immunol., 29, 3956-3961, https://doi.org/ 10.1002/(SICI)1521-4141(199912)29:12<3956::AID-IMMU3956>3.0. CO;2-G.
  10. Matsuda, A., Motoya, S., Kimura, S., McInnis, R., Maizel, A. L., et al. (1998) Disruption of lymphocyte function and signaling in CD45-associated protein-null mice, J. Exp. Med., 187, 1863-1870, https://doi.org/10.1084/jem.187.11.1863.
  11. Kung, C., Okumura, M., Seavitt, J. R., Noll, M. E., White, L. S., et al. (1999) CD45-associated protein is not essential for the regulation of antigen receptor-mediated signal transduction, Eur. J. Immunol., 29, 3951-3955, https:// doi.org/10.1002/(SICI)1521-4141(199912)29:12<3951::AID-IMMU3951>3.0. CO;2-9.
  12. Bruyns, E., Kirchgessner, H., Meuer, S., Schraven, B. (1998) Biochemical analysis of the CD45-p56(Lck) complex in Jurkat T cells lacking expression of lymphocyte phosphatase-associated phosphoprotein, Int. Immunol., 10, 185-194, https://doi.org/10.1093/intimm/10.2.185.
  13. Kitamura, K., Matsuda, A., Motoya, S., Takeda, A. (1997) CD45-associated protein is a lymphocyte-specific membrane protein expressed in two distinct forms, Eur. J. Immunol., 27, 383-388, https://doi.org/10.1002/eji.1830270207.
  14. Hsu, P. D., Scott, D. A., Weinstein, J. A., Ran, F. A., Konermann, S., Agarwala, V., et al. (2013) DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases, Nat. Biotechnol., 31, 827-832, https://doi.org/10.1038/nbt.2647.
  15. Mali, P., Yang, L., Esvelt, K. M., Aach, J., Guell, M., et al. (2013) RNA-guided human genome engineering via Cas9, Science, 339, 823-826, https://doi.org/10.1126/science.1232033.
  16. Ran, F. A., Hsu, P. D., Lin, C.-Y., Gootenberg, J. S., Konermann, S., et al. (2013) Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity, Cell, 154, 1380-1389, https://doi.org/10.1016/j.cell.2013.08.021.
  17. Zotova, A., Pichugin, A., Atemasova, A., Knyazhanskaya, E., Lopatukhina, E., et al. (2019) Isolation of gene-edited cells via knock-in of short glycophosphatidylinositol-anchored epitope tags, Sci. Rep., 9, 3132, https:// doi.org/10.1038/s41598-019-40219-z.
  18. Мазуров Д. В. (2020) В кн. Методы редактирования генов и геномов (под pед. Закияна С. М., Медведева С. П., Дементьевой Е. В., Власова В. В.) Издательство СО РАН, Новосибирск, с. 413-444.
  19. Zotova, A., Lopatukhina, E., Filatov, A., Khaitov, M., and Mazurov, D. (2017) Gene editing in human lymphoid cells: role for donor DNA, type of genomic nuclease and cell selection method, Viruses, 9, 325, https://doi.org/10.3390/v9110325.
  20. Koretzky, G. A., Picus, J., Schultz, T., and Weiss, A. (1991) Tyrosine phosphatase CD45 is required for T-cell antigen receptor and CD2-mediated activation of a protein tyrosine kinase and interleukin 2 production, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 2037-2041, https://doi.org/10.1073/pnas.88.6.2037.
  21. Leitenberg, D., Falahati, R., Lu, D. D., and Takeda, A. (2007) CD45-associated protein promotes the response of primary CD4 T cells to low-potency T-cell receptor (TCR) stimulation and facilitates CD45 association with CD3/TCR and lck, Immunology, 121, 545-554, https://doi.org/10.1111/j.1365-2567.2007.02602.x.
  22. Gaud, G., Lesourne, R., and Love, P. E. (2018) Regulatory mechanisms in T cell receptor signalling, Nat. Rev. Immunol., 18, 485-497, https://doi.org/10.1038/s41577-018-0020-8.
  23. Burr, M. L., Sparbier, C. E., Chan, Y.-C., Williamson, J. C., Woods, K., et al. (2017) CMTM6 maintains the expression of PD-L1 and regulates anti-tumour immunity, Nature, 549, 101-105, https://doi.org/10.1038/nature23643.
  24. Oates, M. E., Romero, P., Ishida, T., Ghalwash, M., Mizianty, M. J., et al. (2012) D2P2: database of disordered protein predictions, Nucleic Acids Res., 41, D508-D516, https://doi.org/10.1093/nar/gks1226.
  25. Uversky, V. N. (2019) Intrinsically disordered proteins and their “mysterious” (meta)physics, Front. Phys., 7, https://doi.org/10.3389/fphy.2019.00010.
  26. Wright, P. E., Dyson, H. J. (2015) Intrinsically disordered proteins in cellular signalling and regulation, Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 16, 18-29, https://doi.org/10.1038/nrm3920.
  27. Marchetti, P., Antonov, A., Anemona, L., Vangapandou, C., Montanaro, M., et al. (2021) New immunological potential markers for triple negative breast cancer: IL18R1, CD53, TRIM, Jaw1, LTB, PTPRCAP, Discov. Oncol., 12, 6, https://doi.org/10.1007/s12672-021-00401-0.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Уровень белков LPAP и CD45 падает в отсутствии белка-партнёра. а – Репрезентативные цитограммы экспрессии LPAP на клетках Jurkat дикого типа (WT), а также на клетках CD45KO или LPAPKO; б – экспрессия LPAP по результатам тестирования 7 клонов CD45KO; в, г – экспрессия CD45 и «посторонних» белков CD59 и CD98 в культурах Jurkat LPAPmKО (в) или в LPAPpKO (г). Уровни экспрессии белков LPAP, CD45, CD59 и CD98 определяли с помощью проточной цитометрии. Нормализованный уровень экспрессии CD45 сравнивали с контрольным значением 100 с помощью одновыборочного t-критерия Стьюдента (б). Для сравнения уровня белков в клетках дикого типа и нокаутных использовали метод ANOVA с post hoc анализом с помощью теста Тьюки (в, г), **** p < 0,0001

Скачать (134KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Уровень CD45 коррелирует с уровнем белка LPAP. а, б – Корреляция между уровнями LPAP и CD45 (а) или LPAP и CD98 (б) в клонах Jurkat LPAPKO с реэкспрессией LPAPWT; в – корреляция между уровнями LPAP и CD45 в клонах Jurkat LPAPWT; г, д – уровень LPAP (г) и CD45 (д) на клетках Jurkat LPAPpKO, стабильно трансдуцированных возрастающей дозой вируса для реэкспрессии LPAPWT (#1, #2, #3) или экспрессии GFP. Экспрессия LPAP нормирована относительно клеток Jurkat LPAPWT. Для CD45 показаны значения для поверхностного (sCD45) и общего (tCD45) уровня; е – корреляция между уровнями LPAP и CD45 в клонах Jurkat LPAPKO, стабильно трансфицированных LPAPWT. Уровни экспрессии определяли по значениям MFI, которые были нормализованы относительно среднего значения для Jurkat WT после вычитания фонового уровня в клетках Jurkat CD45KO или Jurkat LPAPKO. Приведены индивидуальные значения, а также среднее ± SD. Нормализованный уровень экспрессии LPAP в трансдуцированных клетках сравнивали со значением ноль в клетках, экспрессирующих GFP, с помощью одновыборочного t-критерия Стьюдента (г). Для сравнения уровня поверхностного (s) и общего (t) CD45 в клетках Jurkat LPAPpKO и трансдуцентах использовали метод ANOVA с post hoc анализом с помощью теста Тьюки. *** p < 0,001, **** p < 0,0001. Средние значения для уровня LPAP и sCD45 из панели д использованы для расчёта корреляции (е)

Скачать (184KB)
Метаданные
4. Рис. 3. В клетках с повышенной экспрессией LPAP уровень CD45 возрастает. а, б – Уровень белка LPAP анализировали в клеточных линиях Jurkat и Jurkat LPAP-Flag после первой и второй сортировки (sort 1 и sort 2). Клетки лизировали (а, б), белок LPAP или CD45 выделяли с помощью иммунопреципитации (IP) (б), образцы разделяли методом электрофореза в 12%-ном (а) или 18%-ном (б) геле, проводили Вестерн-блоттинг с указанными антителами. Нижний блот (б) окрашивали антителами против Flag и LPAP. Формы LPAP и LPAP-Flag указаны стрелками; в, г – экспрессия LPAP и CD45 на поверхности клеток K562 дикого типа, а также стабильно трансдуцированных LPAP-Flag

Скачать (158KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Сравнение экспрессии молекул CD69 и CD3 на клетках Jurkat дикого типа и с нокаутом по LPAP. а – Экспрессия CD69 на клетках, активированных с помощью РМА; б – экспрессия CD69 на клетках, активированных с помощью антитела OKT3; в – экспрессия CD3 на клетках, активированных с помощью антитела OKT3. Уровни CD69 (б) и CD3 (в) сравнивали с помощью двухвыборочного t-критерия. * p < 0,05, ** p < 0,001, **** p < 0,0001.

Скачать (220KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2024