The role of Vibrio cholerae biofilms in the implementation of resistance to cadmium toxicity

Full Text

Возбудитель холеры в настоящее время представляет существенную угрозу общественному здравоохранению [1]. Одной из причин является способность вибрионов персистировать в окружающей среде на эндемичных территориях, создавая новые очаги заболевания. Бактериальные клетки, находящиеся в составе биоплёнки, способны обмениваться генетической информацией [2], защищены от воздействия неблагоприятных факторов окружающей среды, включая дезинфектанты

 [3], антибиотики [4], что способствует выживанию возбудителя в окружающей среде и его дальнейшему распространению водным путём [5].

Проблема загрязнения окружающей среды тяжёлыми металлами в последние годы привлекла внимание многих исследователей. Тяжёлые металлы, попадая в водные объекты в виде промышленных и сельскохозяйственных  стоков, способны накапливаться в воде и осадках, оказывая серьёзное негативное воздействие на микрофлору водных экосистем и на здоровье человека [6]. Одним из путей преодоления токсического воздействия тяжелых металлов на микроорганизмы является формирование биоплёнок [7, 8].

Очагом сохранения токсигенных Vibrio cholerae традиционно считается регион Бенгальского залива, включающий прибрежные воды и эстуарии Индии и Бангладеш. Кадмий (Cd) является одним из важных загрязнителей окружающей среды в Индии и Бангладеш, оказывая значительное негативное воздействие как на экосистемы, так и на здоровье населения [9, 10]. В ряде случаев концентрация кадмия в сточных водах превышает допустимые нормы, а загрязненные донные отложения были признаны непригодными для любого вида использования [11, 12]. Эти факты вызывают тревогу, учитывая, что для этих эндемичных территорий характерно постоянное выделение возбудителя и появление новых геновариантов, что приводит к регулярным вспышкам заболеваний [13]. Поэтому не вызывает удивления факт обнаружения генетической детерминанты резистентности к Cd czcA в геномах токсигенных вибрионов, выделенных из водоемов Российской Федерации в 2023–2024 гг. [14].

Описаны случаи неоднократного выделения из водных объектов в течение длительного периода генетически идентичных клонов холерного вибриона. Подобные штаммы, способные к длительному сохранению в водных объектах, предложено рассматривать как  персистирующие [15, 16].

 Наиболее демонстративным примером стойкой персистенции являются неоднократные, в течение нескольких лет, случаи контаминации рек Мацесты, Агуры и Мзымты (г. Сочи) в 2024–2025 г. генетически идентичным клоном нетоксигенного V. cholerae [17, 18]. Многократное выделение одного клона свидетельствует о его высоком персистентном потенциале и способности вытеснять других представителей вида. В то же время, сведения о длительной персистенции токсигенных вибрионов в водоёмах Российской Федерации отсутствуют, так как нетоксигенные циркулируют в основном на неэндемичных территориях, а обнаружение токсигенных вариантов расценивается как занос. Механизм персистенции генетически различных V. cholerae в водоёмах в присутствии различных загрязнителей, в том числе тяжёлых металлов, изучен недостаточно, в частности, не установлен вклад феномена формирования биоплёнки.

Цель настоящей работы заключается в изучении  роли сложной биоплёнки, сформированной на хитине, как фактора персистенции  токсигенных и нетоксигенных V. cholerae в условиях токсического воздействия Cd.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали два штамма V. сholerae El Tor О1 токсигенный  5342  ctxA+ csh1-, выделен от человека в 2023 году в результате заноса из Индии [19] и нетоксигенный штамм 643 ctxA-  csh1+ изолированный из воды реки Мацеста (г. Сочи) в  2025 году, который представляет персистирующий генотип, поскольку штаммы с таким генотипом неоднократно выделяли из рек г. Сочи в 2024-2025 гг. [17–18].

Формирование сложных биоплёнок двумя штаммами V. cholerae различного происхождения проводили по ранее описанному методу [20] на фрагментах хитинового экзоскелета речного рака Astacus astacus размером 5×5 мм, которые помещали в стандартные пенициллиновые флаконы с физиологическим раствором. Содержание жизнеспособных клеток в супернатанте определяли бактериологически путём прямого высева на пластины агара Мартена, а в составе биоплёнок методом истощения отпечатков [20]. При оценке возможного воздействия Cd на процесс адгезии к фрагментам хитина и последующего формирования биопленки добавление взвеси двух штаммов (концентрация каждого штамма составляла 10⁶ КОЕ/мл) и раствора Cd в среду инкубации для достижения необходимой концентрации осуществляли одновременно. Для изучения влияния ионов Cd на зрелую биоплёнку  фрагменты хитина  контаминировали этой же взвесью двух штаммов и через пять дней дополнительной инкубации добавляли раствор Cd до достижения соответствующей концентрации. В контрольные пробы Cd не добавляли. Экспериментальные и контрольные пробы культивировали в одинаковых условиях, при температуре 25 ^оС. Все эксперименты проводили в трех повторностях.  

Выявление молекулярных маркеров генов используемых штаммов: ctx для детекции штамма V. сholerae El Tor О1 5342 и csh1 для детекции персистентного штамма V. сholerae El Tor О1 643  проводили в мультиплексной ПЦР-РВ с использованием праймеров и зондов для соответствующих генов [21]. С этой целью  проводили высев биоплёнки путем отпечатков фрагментов хитина или планктонной фазы на агар Мартена, рН 7,6 (48 часов при 37 С) и затем из клеток, сформировавших газон культуры, выделяли суммарную ДНК и с помощью ПЦР-РВ детектировали  ДНК-маркер соответствующего штамма V. cholerae.

Оценку биоплёнкообразования проводили с помощью световой микроскопии с двойным окрашиванием. Образцы сначала окрашивали Конго красным для выявления экзогенного липополисахарида окрашиваемого в розовый цвет, а затем пробы докрашивали карболовым фуксином для выявления бактериальных клеток [20]. Для проведения люминесцентной микроскопии образцы супернатанта обрабатывали иммуноглобулинами диагностическими флюоресцирующими холерными адсорбированными, учет проводили по появлению специфического свечения.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Поскольку процесс формирования биоплёнки начинается с адгезии клеток к поверхности и образования первичного монослоя [22] в первой серии экспериментов было изучено влияние различных концентраций Cd на раннюю стадию адгезии и формирование биоплёнки вибрионами. Результаты эксперимента представлены  в таблице 1.

В контрольных пробах (без добавления Cd) после суток и на пятые сутки инкубации в отпечатках биоплёнок и высевах из супернатанта наблюдался рост V. cholerae в виде сплошного газона. При исследовании методом ПЦР-РВ во всех образцах подтверждено наличие маркеров токсигенного ctx и нетоксигенного csh1 штаммов вибрионов, что доказывало жизнеспособность двух культур.

Результаты после добавления Cd до конечной концентрации 0,01 mM после суток инкубации существенно не отличались от контрольных образцов. Однако на пятые сутки инкубации жизнеспособными в биоплёнке и в супернатанте оставались только клетки нетоксигенного штамма 643, в то время клетки токсигенного штамма 5342 утратили жизнеспособность, при этом молекулярный маркер ctx был обнаружен только в супернатанте.

При воздействии более высокой концентрации Cd 0,05 mM после первых суток инкубации наблюдали гибель обеих штаммов в супернатанте при сохранении молекулярных маркеров, исчезнувших к пятым суткам инкубации. В биоплёнке во все сроки исследования обнаружено наличие жизнеспособных клеток только штамма 643 и их маркеров.

В присутствии  0,1 мМ Cd в  биоплёнках и супернатанте после первых суток установлено наличие ДНК нетоксигенного штамма 643, но жизнеспособных клеток не обнаружено. К пятым суткам инкубации отмечено исчезновение маркеров обеих штаммов. Повышение концентрация кадмия до 0,2 мМ привело к отсутствию жизнеспособных клеток и специфической ДНК во все сроки эксперимента (Таблица 1).

Таблица 1.

Во второй серии экспериментов изучали влияние повышенных концентраций Cd на образцы, содержащие зрелую сложную биоплёнку, сформированную на фрагментах хитина штаммами V. cholerae El Tor  О1 643 и 5342. Результаты эксперимента приведены в таблице 2. Через пять суток воздействия тяжёлого металла во всех исследованных пробах биоплёнок и супернатанта обнаружено наличие как ДНК маркеров, так и жизнеспособных клеток изучаемых штаммов даже при максимальной использованной концентрации Cd (0,6 мМ).  

Таблица 2.

Дополнительные эксперименты, показали, что планктонные формы штаммов V. cholerae El Tor  О1 5342 и 643, приготовленные путем суспендирования агаровых культур в физиологическом растворе, полностью теряют жизнеспособность уже через 2 часа инкубации при воздействии 0,1 мМ Cd.

Для объяснения наблюдаемого противоречия – наличие жизнеспособных клеток холерного вибриона в супернатанте с заведомо токсичной концентрацией Cd мы исследовали образцы супертаната над зрелой биоплёнкой с помощью световой (Рисунок 1) и люминесцентной (Рисунок 2) микроскопии. Показано, что в супернатанте над хитином холерные вибрионы присутствуют в двух формах – изолированные клетки и крупные фрагменты биоплёнки, образованные в результате десквамации. Поэтому вибрионы в составе фрагментов биоплёнки защищены от токсического воздействия Cd.

Рисунок 1

Рисунок 2.

Обсуждение

Полученные результаты свидетельствуют о том, что без внешнего воздействия токсигенный штамм V. cholerae El Tor 5342 (ctx⁺), выделенный от человека, и  нетоксигенный «персистирующий» V. cholerae El Tor 643 (csh1⁺), изолированный из воды, способны формировать сложную биоплёнку на хитине. Изученные штаммы различались по устойчивости к ингибирующему воздействию Cd. Штамм 643 был способен адгезировать и формировать биоплёнку в присутствии Cd (0,01 и 0,05 мМ), в то время как адгезия токсигенного штамма полностью подавлялась в таких условиях. На наш взгляд, полученный результат может отчасти объяснить длительную персистенцию вибрионов клонального комплекса, представленного штаммом 643,  в водоёмах города Сочи.

В случае зрелой сложной биоплёнки оба штамма сохраняли жизнеспособность в биоплёнке и супернатанте даже при воздействии заведомо токсичных концентраций тяжёлого металла (до 0,6 мМ). Присутствие жизнеспособных клеток в супернатанте над зрелой биоплёнкой, вероятно, обусловлено дисперсией, при которой клетки постоянно высвобождаются из матрикса биоплёнки и переходят в свободное состояние [22, 23]. Скорее всего, дисперсия происходит за счет отрыва (отслаивания) фрагментов биоплёнки в которых бактериальные клетки защищены матриксом [24]. Подобный механизм может играть важную роль в поддержании циркуляции холерных вибрионов в природных водоёмах, когда часть вибрионов входит в состав частиц размером более 20 мкм [25].

Выявление ДНК при отсутствии жизнеспособных клеток вибрионов, по-видимому, является следствием гибели бактерий в результате токсического воздействия при сохранении их генетического материала. Подобный феномен – отсутствие жизнеспособных клеток при наличии их ДНК описан при проведении мониторинга холеры [26].  Это обстоятельство необходимо учитывать при интерпретации результатов молекулярно-генетического мониторинга загрязнённых водоёмов.

Несмотря на то, что использованные в эксперименте концентрации Cd превышают максимальные значения, регистрируемые в природных водных объектах [11], полученные данные демонстрируют принципиальную возможность сохранения холерных вибрионов в составе биоплёнок при воздействии тяжёлых металлов. В условиях природных экосистем, характеризующихся комплексным загрязнением [6, 9] и наличием биотических субстратов, данный механизм может способствовать длительной персистенции V. cholerae.

Известно, что условия водной среды, включая сезонные колебания химического состава воды, могут влиять на выживаемость холерных вибрионов во внешней среде. Например, прохладный зимний сезон в Юго-Восточной Азии характеризуется более высокими показателями загрязнений тяжёлыми металлами [27, 28], что способно изменять условия существования микробных сообществ в водоёмах. Полученные в настоящей работе результаты демонстрируют, что вибрионы, находящиеся в составе биоплёночных структур, могут сохранять жизнеспособность при воздействии токсических концентраций Cd, что позволяет рассматривать биоплёночную форму как один из возможных механизмов сохранения популяций V. cholerae в неблагоприятных экологических условиях, в том числе в водоемах загрязненных тяжёлыми металлами.

Заключение

Зрелая биоплёнка V. cholerae, сформированная на хитиновом субстрате, обеспечивает сохранение жизнеспособности возбудителя при воздействии концентраций Cd, летальных для планктонных форм. Устойчивость холерных вибрионов к токсическому воздействию Cd определяется стадией биоплёночного цикла: клетки на стадии адгезии характеризуются высокой чувствительностью к токсиканту, тогда как зрелая биоплёнка выполняет защитную функцию. Различия в реакции токсигенного и нетоксигенного персистентного штаммов V. cholerae на воздействие Cd на стадии адгезии могут отражать особенности их экологической адаптации. Полученные данные позволяют рассматривать биоплёночные структуры, формирующиеся на хитинсодержащих биотических субстратах, как один из механизмов сохранения популяций V. cholerae в водных экосистемах, загрязнённых тяжёлыми металлами, за счёт повышения устойчивости клеток к токсическому воздействию. Результаты настоящей работы получены в условиях лабораторной модели и требуют дальнейшего изучения в системах, приближённых к природным водным экосистемам. Степень загрязнения водоёмов хитинсодержащими субстратами следует рассматривать как важный фактор, обеспечивающий длительную персистенцию вибрионов в водоемах, загрязненных тяжёлыми металлами.

ТАБЛИЦЫ

Таблица 1.  Оценка влияния различных концентраций Cd на формирование сложной биоплёнки штаммами V. cholerae El Tor  О1 643 и 5342,  на основании выявления жизнеспособных клеток и маркерных генов csh1, ctx с помощью мультиплексой ПЦР-РВ

Table 1. Assessment of the effect of different Cd concentrations on the formation of complex biofilms by V. cholerae El Tor O1 643 and 5342 strains, based on the detection of viable cells and marker genes csh1 and ctx using multiplex real-time PCR.

Примечания: БП- биоплёнка, СН –супернатант; +/- наличие /отсутствие  роста V. cholerae,  +\-  данный ген обнаружен\ не обнаружен с помощью ПЦР-РВ  в исходном материале или после подращивания на агаре, +\0 ген обнаружен при отсутствии жизнеспособных клеток V. cholerae,  -\0 ген не обнаружен, жизнеспособные клетки V. cholerae  отсутствуют. 

Таблица 2  Оценка влияния различных концентраций Cd на зрелую сложную  биоплёнку, образованную штаммами V.cholerae El Tor  О1 643 и 5342 на пятые сутки инкубации, на основании выявления жизнеспособных клеток и маркерных генов csh1, ctx с помощью мультиплексой ПЦР-РВ.

Table 2. Assessment of the effect of different Cd concentrations on mature complex biofilms formed by V. cholerae El Tor O1 643 and 5342 strains on the fifth day of incubation, based on the detection of viable cells and marker genes csh1, ctx using multiplex real-time PCR.

Примечания: БП- биоплёнка, СН –супернатант; +/- наличие /отсутствие  роста V. cholerae,  +\-  данный ген обнаружен\ не обнаружен с помощью ПЦР-РВ  в исходном материале или после подращивания на агаре, +\0 ген обнаружен при отсутствии жизнеспособных клеток V. cholerae,  -\0 ген не обнаружен, жизнеспособные клетки V. cholerae  отсутствуют. 

ИЛЛЮСТРАЦИИ

Рисунок 1. Образец супертанта, полученного из образца со зрелой биоплёнкой, на пятые сутки после добавления Cd до конечной концентрации 0,6 мМ после окрашивания Конго красным и карболовым фуксином. Увеличение 10х100. Присутствуют изолированные клетки холерных вибрионов в виде палочек красного цвета и фрагменты десквамированной биоплёнки, окрашенные в розовый цвет.    

Figure 1. A supernatant sample obtained from a sample with a mature biofilm on the fifth day after adding Cd to a final concentration of 0.6 mM after staining with Congo red and carbol fuchsin. Magnification 10x100. There are isolated cells of Vibrio cholerae in the form of red-colored rods and fragments of desquamated biofilm that are pink in color.

Рисунок 2. Образец супертанта, полученного из образца со зрелой биопленкой, на пятые сутки после добавления Cd до конечной концентрации 0,6 мМ после обработки иммуноглобулинами диагностическими флюоресцирующими холерными адсорбированными. Присутствуют изолированные клетки холерных вибрионов в виде палочек зелёного  цвета и фрагмент десквамированной биоплёнки.

Figure 2. A supernatant sample obtained from a sample with a mature biofilm on the fifth day after adding Cd to a final concentration of 0.6 mM after treatment with diagnostic fluorescent cholera adsorbed immunoglobulins. There are isolated cells of cholera vibrios in the form of green rods and a fragment of a desquamated biofilm.

About the authors

Vodopyanov Sergey Olegovich

Email: sergr100V@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-4336-0439
SPIN-code: 4672-9310

Svetlana Victorovna Titova

Email: titova_sv@antiplague.ru
ORCID iD: 0000-0002-7831-841X
SPIN-code: 5695-2103

Artem Vladimirovich Evteev

Email: evteev_av@antiplague.ru
ORCID iD: 0000-0002-0087-9153
SPIN-code: 6050-0361

Asmik Konstantinivna Zubkova

Author for correspondence.
Email: zubkova_ak@antiplague.ru
SPIN-code: 3297-4640

Elena Arkadjevna Menshikova

Email: menshikova_ea@antiplague.ru
ORCID iD: 0000-0002-6003-4283
SPIN-code: 6367-4404

Victoria Aleksandrovna Korshenko

Email: korshenko_va@antiplague.ru
ORCID iD: 0000-0001-7126-4327

References

Supplementary files