Justification of the use of cell culture in the epidemiological surveillance system for tick-borne infections.

Full Text

Введение

В системе эпидемиологического надзора за риккетсиозами существенное значение имеют лабораторные методы исследования, в том числе мониторинг штаммов возбудителя и надзор за источниками инфекции [Тарасевич, 1981]. Одним из главных звеньев в системе эпидемиологического надзора за клещевыми риккетсиозами является комплекс микробиологических (риккетсиологических) методов для установления факта циркуляции возбудителя и внутривидового типирования.

Актуальным является выбор алгоритма лабораторной диагностики, которая будет отличаться доступностью и точностью верификации возбудителя. Лабораторная диагностика клещевых риккетсиозов в РФ осуществляется в соответствии с действующими нормативными и методическими документами. Она включает микробиологическую (риккектсиологическую) диагностику (выделение штаммов и накопление их биомасс , определение их принадлежности к группе КПЛ), серологическую диагностику (выявление антител к антигенам риккетсий) и молекулярно-биологическую диагностику (генотипирование ДНК риккетсий в переносчиках и образцах клинического материала и секвенирование штаммов). Для индикации и идентификации риккетсий применяют комплекс классических методов: (культивирование на лабораторных животных и куриных эмбрионах), молекулярно – биологический метод (ПЦР-секвенирование) и биотехнологический (клещевая экспериментальная модель воспроизведения естественного цикла развития иксодид и длительно культивируемые линии клеток млекопитающих) методы [Samoylenko I. et al., 2009].

На эндемичных территориях применение метода биопроб обеспечивает выявление вирулентных штаммов риккетсий с их последующей изоляцией и изучением иммунобиологических свойств, но он не пригоден для оценки уровня индивидуальной инфицированности переносчиков.

Несмотря на более высокую, по сравнению с морскими свинками, чувствительность куриных эмбрионов, первичная изоляция риккетсий на этой модели затруднена в связи со значительной контаминацией переносчиков посторонней микрофлорой. Кроме того , использование биопробы на куриных эмбрионах не всегда позволяет накопить достаточное количество риккетсий апатогенных для человека видов . В то же время, куриные эмбрионы остаются эффективной моделью для накопления биомасс вирулентных риккетсий группы КПЛ с целью последующего изучения фенотипических характеристик. Клещевая экспериментальная модель (КЭМ) является сезонным методом и очень трудоемким. Метод с использованием культур клеток находил и находит широкое применение для изучения биологических свойств, получения цельнорастворимых и корпускулярного антигенов риккетсий известных патогенов и новых видов [Сомов Г. П.,1964; Рыбкина Н.Н.,1961; Рудаков 2001].

Методы исследования: В работе были использованы общепринятые зоолого-паразитологические, эпидемиологические (ретроспективный анализ с описательными и аналитическими исследованиями), риккетсиологические (культивирование риккетсий на культурах клеток, биопробах животных), серологические (РНИФ, РСК, ИФА), молекулярно-биологические (ПЦР, секвенирование по Сэнгеру), статистические методы исследования.

Используемые средства: (питательные среды (Игла МеМ), эмбриональная сыворотка, для культивирования клеточных культур), световой и люминесцентный микроскопы, чистые  клеточные культуры Hep-2, Vero, лабораторные животные, диагностикум риккетсиозный sibirica для РСК производства АО «НПО «Микроген» (Пермь), наборы для ПЦР «АмплиПрайм РИБО-преп» компании «ИнтерЛабСервис» (Москва) и набором реагентов «РеалБест экстракция 100» ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск), наборы для ИФА.

Объекты исследования: иксодовые клещи, штаммы риккетсий, культуры клеток, сыворотки крови больных клещевыми инфекциями.

Результаты

Для индикации и идентификации риккетсий мы использовали культуры клеток. Использование культуры клеток позволяет проводить наиболее полное изучение всех вариантов риккетсий в популяции. С помощью этой модели удалось выделить риккетсии новых видов (R. raoultii, Candidatus R. tarasevichiae) из отдельной особи клеща, а не из пулов, как было ранее. Выделен, прокультивирован и изучен штамм - кандидат в новый вид риккетсий Candidatus R. tarasevichiae, определена высокая инфицированность клещей I. persulcatus этим микроорганизмом на ряде территорий России. При использовании культуры клеток Vero и Hep-2 из клещей D. niveus в Южном Казахстане изолированы и идентифицированы впервые штаммы риккетсии новых генотипов R. raoultii.

Показана возможность использования культивирования на клеточных культурах как дополнительного метода  для штаммов как известных видов патогенных риккетсий, выделенных на морских свинках и куриных эмбрионах (R. sibirica, R. heilongengensis), так и новых патогенов, R. slovaca. С помощью культуры клеток нам удалось накопить биомассу этих риккетсий и получить цельнорастворимые корпускулярные антигены для разработки тест-систем для ИФА проведения серологических реакций (РСК, РНИФ) с сыворотками больных. В результате проведенных исследований отработана тактика применения тест-системы ИФА для выявления антител к риккетсиям группы КПЛ при исследовании сывороток крови людей в комплексе с другими методами как на эндемичных территориях по КПЛ.

На основании анализа серологических и молекулярно-биологических методов исследования, выявления возбудителей в переносчиках и обобщенных литературных данных нами разработан алгоритм лабораторного обследования больных с подозрением на клещевые риккетсиозы группы КПЛ. Мы считаем целесообразным начинать изучение популяций риккетсий в природных очагах с определения индивидуальной инфицированности переносчиков одним из методов. К таким методам можно отнести: культуру клеток, ПЦР, МФА с поликлональными антителами и ИФА. Образцы переносчиков, положительные в культуре клеток, ПЦР и ИФА следует изучать в РНИФ с МКА и далее проводить секвенирование по генам gltA . Для всестороннего изучения новых генотипов риккетсий группы КПЛ мы рекомендуем использовать культуру клеток в сочетании с другими методами. Наличие или отсутствие вирулентных свойств выделенных возбудителей определять с использованием традиционных риккетсиологических моделей (биопробы на морских свинках, куриных эмбрионах, КЭМ и другие) (Схема. 1).

 

Схема 1 – Алгоритм микробиологического мониторинга природных очагов клещевых риккетсиозов.

 

На основании полученных нами данных можно рекомендовать использование разработанных антигенов для создания тест-системы для ИФА в комплексе с другими лабораторными методами при осуществлении эпидемиологического надзора на эндемичных территориях. Использование слайд-антигенов и ИФА в практическом здравоохранении позволит улучшить серодиагностику клещевых риккетсиозов, а предложенная схема исследования сывороток от больных в очагах КР может быть использована с антигенами различных видов риккетсий (схема 2).

 

Схема 2 – Схема исследование сывороток от больных с различными антигенами в очагах КР.

 

Заключение

Таким образом, предложенный нами алгоритм  и схемы исследования являются универсальными и могут быть использованы с антигенами различных видов риккетсий в зависимости от их на определённых территориях. При проведении комплексного лабораторного обследования и применении микробиологических, серологических и молекулярно-биологических методов показана их высокая эффективность в выделении и идентификации штаммов в системе эпидемиологического надзора за инфекциями, вызванными риккетсиями.

 

Введение

В системе эпидемиологического надзора за риккетсиозами существенное значение имеют лабораторные методы исследования, в том числе мониторинг штаммов возбудителя и надзор за источниками инфекции [Тарасевич, 1981]. Одним из главных звеньев в системе эпидемиологического надзора за клещевыми риккетсиозами является комплекс микробиологических (риккетсиологических) методов для установления факта циркуляции возбудителя и внутривидового типирования.

Актуальным является выбор алгоритма лабораторной диагностики, которая будет отличаться доступностью и точностью верификации возбудителя. Лабораторная диагностика клещевых риккетсиозов в РФ осуществляется в соответствии с действующими нормативными и методическими документами. Она включает микробиологическую (риккектсиологическую) диагностику (выделение штаммов и накопление их биомасс , определение их принадлежности к группе КПЛ), серологическую диагностику (выявление антител к антигенам риккетсий) и молекулярно-биологическую диагностику (генотипирование ДНК риккетсий в переносчиках и образцах клинического материала и секвенирование штаммов). Для индикации и идентификации риккетсий применяют комплекс классических методов: (культивирование на лабораторных животных и куриных эмбрионах), молекулярно – биологический метод (ПЦР-секвенирование) и биотехнологический (клещевая экспериментальная модель воспроизведения естественного цикла развития иксодид и длительно культивируемые линии клеток млекопитающих) методы [Samoylenko I. et al., 2009].

На эндемичных территориях применение метода биопроб обеспечивает выявление вирулентных штаммов риккетсий с их последующей изоляцией и изучением иммунобиологических свойств, но он не пригоден для оценки уровня индивидуальной инфицированности переносчиков.

Несмотря на более высокую, по сравнению с морскими свинками, чувствительность куриных эмбрионов, первичная изоляция риккетсий на этой модели затруднена в связи со значительной контаминацией переносчиков посторонней микрофлорой. Кроме того , использование биопробы на куриных эмбрионах не всегда позволяет накопить достаточное количество риккетсий апатогенных для человека видов . В то же время, куриные эмбрионы остаются эффективной моделью для накопления биомасс вирулентных риккетсий группы КПЛ с целью последующего изучения фенотипических характеристик. Клещевая экспериментальная модель (КЭМ) является сезонным методом и очень трудоемким. Метод с использованием культур клеток находил и находит широкое применение для изучения биологических свойств, получения цельнорастворимых и корпускулярного антигенов риккетсий известных патогенов и новых видов [Сомов Г. П.,1964; Рыбкина Н.Н.,1961; Рудаков 2001].

Методы исследования: В работе были использованы общепринятые зоолого-паразитологические, эпидемиологические (ретроспективный анализ с описательными и аналитическими исследованиями), риккетсиологические (культивирование риккетсий на культурах клеток, биопробах животных), серологические (РНИФ, РСК, ИФА), молекулярно-биологические (ПЦР, секвенирование по Сэнгеру), статистические методы исследования.

Используемые средства: (питательные среды (Игла МеМ), эмбриональная сыворотка, для культивирования клеточных культур), световой и люминесцентный микроскопы, чистые  клеточные культуры Hep-2, Vero, лабораторные животные, диагностикум риккетсиозный sibirica для РСК производства АО «НПО «Микроген» (Пермь), наборы для ПЦР «АмплиПрайм РИБО-преп» компании «ИнтерЛабСервис» (Москва) и набором реагентов «РеалБест экстракция 100» ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск), наборы для ИФА.

Объекты исследования: иксодовые клещи, штаммы риккетсий, культуры клеток, сыворотки крови больных клещевыми инфекциями.

Результаты

Для индикации и идентификации риккетсий мы использовали культуры клеток. Использование культуры клеток позволяет проводить наиболее полное изучение всех вариантов риккетсий в популяции. С помощью этой модели удалось выделить риккетсии новых видов (R. raoultii, Candidatus R. tarasevichiae) из отдельной особи клеща, а не из пулов, как было ранее. Выделен, прокультивирован и изучен штамм - кандидат в новый вид риккетсий Candidatus R. tarasevichiae, определена высокая инфицированность клещей I. persulcatus этим микроорганизмом на ряде территорий России. При использовании культуры клеток Vero и Hep-2 из клещей D. niveus в Южном Казахстане изолированы и идентифицированы впервые штаммы риккетсии новых генотипов R. raoultii.

Показана возможность использования культивирования на клеточных культурах как дополнительного метода  для штаммов как известных видов патогенных риккетсий, выделенных на морских свинках и куриных эмбрионах (R. sibirica, R. heilongengensis), так и новых патогенов, R. slovaca. С помощью культуры клеток нам удалось накопить биомассу этих риккетсий и получить цельнорастворимые корпускулярные антигены для разработки тест-систем для ИФА проведения серологических реакций (РСК, РНИФ) с сыворотками больных. В результате проведенных исследований отработана тактика применения тест-системы ИФА для выявления антител к риккетсиям группы КПЛ при исследовании сывороток крови людей в комплексе с другими методами как на эндемичных территориях по КПЛ.

На основании анализа серологических и молекулярно-биологических методов исследования, выявления возбудителей в переносчиках и обобщенных литературных данных нами разработан алгоритм лабораторного обследования больных с подозрением на клещевые риккетсиозы группы КПЛ. Мы считаем целесообразным начинать изучение популяций риккетсий в природных очагах с определения индивидуальной инфицированности переносчиков одним из методов. К таким методам можно отнести: культуру клеток, ПЦР, МФА с поликлональными антителами и ИФА. Образцы переносчиков, положительные в культуре клеток, ПЦР и ИФА следует изучать в РНИФ с МКА и далее проводить секвенирование по генам gltA . Для всестороннего изучения новых генотипов риккетсий группы КПЛ мы рекомендуем использовать культуру клеток в сочетании с другими методами. Наличие или отсутствие вирулентных свойств выделенных возбудителей определять с использованием традиционных риккетсиологических моделей (биопробы на морских свинках, куриных эмбрионах, КЭМ и другие) (Схема. 1).

 

Схема 1 – Алгоритм микробиологического мониторинга природных очагов клещевых риккетсиозов.

 

На основании полученных нами данных можно рекомендовать использование разработанных антигенов для создания тест-системы для ИФА в комплексе с другими лабораторными методами при осуществлении эпидемиологического надзора на эндемичных территориях. Использование слайд-антигенов и ИФА в практическом здравоохранении позволит улучшить серодиагностику клещевых риккетсиозов, а предложенная схема исследования сывороток от больных в очагах КР может быть использована с антигенами различных видов риккетсий (схема 2).

 

Схема 2 – Схема исследование сывороток от больных с различными антигенами в очагах КР.

 

Заключение

Таким образом, предложенный нами алгоритм  и схемы исследования являются универсальными и могут быть использованы с антигенами различных видов риккетсий в зависимости от их на определённых территориях. При проведении комплексного лабораторного обследования и применении микробиологических, серологических и молекулярно-биологических методов показана их высокая эффективность в выделении и идентификации штаммов в системе эпидемиологического надзора за инфекциями, вызванными риккетсиями.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

About the authors

Liudmila Valerievna Kumpan

Omsk State Medical University of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation, Omsk Research Institute of Natural-Focal Infections

Author for correspondence.
Email: Ludmilavirus@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-5230-1388

доктор медицинских наук, доцент, зав. кафедрой микробиологии, вирусологии и иммунологии, старший научный сотрудник

Russian Federation

Irina Evgenevna Samoylenko

Email: samoilenko.irinasamoylenko@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-2819-9280
Russian Federation

Nikolai Viktorovich Rudakov

Email: rickettsia@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-9566-9214

Natalia Valerievna Abramova

Email: abnata@mail.ru

Elena Valerievna Matuschenko

Email: omien@yandex.ru

Natalia Vladimirovna Temnikova

Email: nattemnikova@yandex.ru

References

Supplementary files