STUDY OF THE ACTIVITY OF A POSTBIOTIC BASED ON THE ENTEROCOCCUS FAECIUM L-3 STRAIN TO OPTIMIZE THE QUALITATIVE AND QUANTITATIVE COMPOSITION OF HUMAN MICROBIOTA UNDER CONDITIONS OF LONG-TERM ISOLATION IN CONFINED HABITAT

Full Text

Обоснование

Поддержание нормального физиологического статуса естественных барьеров колонизации у человека в искусственной среде обитания является одним из важнейших направлений в физиологии. Первый и основной барьер колонизации формируется за счет индигенной микрофлоры. Известно, что микробиота любых биотопов человека индивидуальна и реагирует не только на внешние факторы (изменение режима питания, частоты и качества гигиенических процедур), но и на психоэмоциональное напряжение. Стресс может спровоцировать ряд негативных сдвигов в микробиоте, например, активное размножение условно-патогенного компонента и снижение количества протективных видов бактерий.

Особенно важно поддерживать микробиоту кишечника и других органов в экстремальных условиях (космических полетах, модельных изоляционных экспериментах и пр.), поскольку уже доказано негативное влияние факторов космического полёта на микробиоту человека выражающееся, в первую очередь, в снижении колонизационной резистентности практически всех биотопов. Использование в качестве средств профилактики дисбиотических состояний и борьбы с условно-патогенной и патогенной микрофлорой антибактериальных препаратов не даёт необходимого эффекта, при том, что имеются сведения о том, что некоторые патогенные микроорганизмы становятся менее чувствительными к антибактериальным препаратам в условиях микрогравитации, что приводит к более высокой минимальной ингибирующей концентрации препаратов, необходимой для их эрадикации.

Многочисленными ранее проводимыми исследованиями показано, что в условиях изоляции развиваются системные дисбиозы, поэтому необходимо оценить эффективность использование препаратов, экологически комплементарных человеческому организму для коррекции дисбаланса микробиоты человека в различных биотопах. Накопленный опыт свидетельствует о том, что пробиотики, в первую очередь аутопробиотики, являются весьма эффективными средствами управления системой «человек-микроорганизмы» в искусственной среде обитания, какой является космический полет. Между тем, при реализации дальних полётов, профилактические меры на основе пробиотических препаратов представляется рискованным из-за ограниченных сроков годности. Поэтому перспективными представляются пребиотики post-mortem (постбиотики), т.е. инактивированные микробные клетки, в том числе в составе пищевых продуктов [1, 2, 3].

Цель пилотного исследования – оценка эффективности и безопасности постбиотика в виде хлеба с инактивированной культурой пробиотического штамма Enterococcus faecium L3. на количественные и качественные показатели микробиома кишечника, носа и глотки испытателей в условиях 60- суточной изоляции.

ОПИСАНИЕ эксперимента

Шестеро мужчин репродуктивного возраста участвовали в 60-дневной изоляции в Наземном Экспериментальном Комплексе ГНЦ РФ ИМБП РАН. Все обследуемые за 3 дня до взятия проб находились на диете, предусматривающей исключение из пищи продуктов, усиливающих процесс брожения в кишечнике, алкоголь, антимикробные лекарственные препараты.

При микробиологических исследованиях кишечника у здоровых лиц использовались пробы кала после естественной дефекации, который собирается в стерильный герметичный контейнер с плотно закрывающейся крышкой. 1 г нативной пробы фекалий разводили в 9 мл физиологического раствора - получая исходное разведение 10¹. Из исходного разведения приготовляли последовательные десятикратные разведения и осуществляли посев на селективные среды: кровяной агар, среда Эндо, маннитол-солевой агар для выделения стафилококков, среда Сабуро для выделения дрожжей и дрожжеподобных микроорганизмов, Среда Энтеро для энтерококков, цитратный агар Симмонса, среда MRS 2, MRS 4 для выделения лактобацилл, среда Бифидум, среда SPS для выделения клостридий. Все среды инкубировали при 37 ℃ 48 часов, чашки со средой Сабуро оставляли на 48 часов при комнатной температуре еще на 48 часов. Анаэробы культивировали в анаэростате. После инкубации проводили подсчет колоний каждого вида, на плотных средах с учетом степени разведения кала

Отбор проб из глотки и полости носа осуществлялся натощак, до чистки зубов, с помощью тампонов с транспортными средами «Амиес с углём» /Copan, Италия/. Суспендирование проб с тампонов производилась в стерильном физиологическом растворе. После эмульгирования производилась раститровка первоначальной концентрации суспензии микроорганизмов в 3-4 раза, путём последовательного переноса 0,5 мл материала из пробирки с первоначальной концентрацией в последующую. Посев производился стеклянным шпателем, аэробным путём, газоном на питательные среды: кровяной агар, среда Эндо, маннитол-солевой агар, среда Сабуро, Среда Энтеро, цитратный агар Симмонса, среда MRS 2, MRS 4 для выделения лактобацилл, среда Бифидум, среда SPS для выделения клостридий. Инкубация микроорганизмов осуществлялась 24 часа, 48 часов – на агаре Сабуро.

Первичная идентификация микроорганизмов производилась методом микроскопирования культуральных мазков с окраской по Граму. Микробиологические исследования у здоровых лиц производились в лаборатории микроэкологии человека ГНЦ РФ – Института медико-биологических проблем РАН. При учёте результатов учитывали, что кишечная микрофлора человека – весьма лабильная система, подверженная колебаниям в зависимости от многих эндогенных и экзогенных факторов, поэтому проводились 2-х кратные исследования с небольшим интервалом. По характеру отклонений микрофлоры кишечника от нормы, определяли степень дисбиоза.

Статистическая обработка результатов. По результатам исследований рассчитывали эубиотический индекс. Все полученные количественные данные обрабатывались с помощью статистической программы Statistica 6 и 10. Использовались параметрические и непараметрические методы статистики. Степень достоверности различий определялась по методу Стьюдента.

Микробиологические исследования производились в лаборатории микробной экологии человека ГНЦ РФ – Института медико-биологических проблем РАН.

Постбиотик с использованием хлеба был изготовлен в НИИ Хлебопекарной промышленности.

Способ приготовления хлеба

При приготовлении хлеба использовали муку пшеничную хлебопекарную первого сорта, муку ржаную хлебопекарную обдирную, воду питьевую, дрожжи хлебопекарные прессованные, соль пищевую, сахар белый. Тесто готовили в лабораторных условиях по рецептуре хлеба, представленной в таблице 1, с использованием густой ржаной закваски (25 % муки в закваске). В качестве опытных образцов вырабатывали хлеб с добавлением инактивированной культуры пробиотического штамма Enterococcus faecium L3,  контрольный образец хлеба – по представленной рецептуре, без добавлений.

Таблица 1 – Рецептура хлеба

Наименование сырья	Расход сырья (кг) для хлеба
	Контроль (без добавления инактивированной культуры пробиотического штамма Enterococcus faecium L3	Опыт (с добавлением инактивированной культуры пробиотического штамма Enterococcus faecium L3)
Мука ржаная хлебопекарная обдирная	50,0	50,0
Мука пшеничная хлебопекарная первого сорта	50,0	50,0
Соль пищевая	1,5	1,5
Дрожжи хлебопекарные прессованные	0,5	0,5
Сахар белый	3,0	3,0
Инактивированная культура пробиотического штамма Enterococcus faecium L3	-	8,33

 

Инактивированную культуру пробиотического штамма Enterococcus faecium L3 вносили при замесе теста в виде бульона (10х⁸ КОЕ на мл), предварительно разведённую в воде. Замес теста производили из всего сырья в течение 12 мин до получения однородной консистенции. Брожение теста осуществляли в течение 60 мин. После брожения тесто разделывали на куски массой 0,06 кг, направляли в расстойный шкаф и выпекали при температуре 200 ⁰С.  Потребление хлеба испытателями осуществлялось три раза в день в течение 30 дней.

При расчетах использовался «Эубиотический индекс», представляющий собой отношение числа положительных изменений в составе исследованных групп микроорганизмов.

К положительным изменениям относятся:

- повышение или стабилизация количества протективных микроорганизмов на приемлемом уровне

- снижение или стабилизация количества условно-патогенных микроорганизмов на приемлемом уровне

К отрицательным изменениям относятся

- снижение или стабилизация количества протективных микроорганизмов на неприемлемо низком уровне

- повышение или стабилизация количества условно-патогенных микроорганизмов на неприемлемо высоком уровне.

Штамм Enterococcus faecium L3 был предоставлен Институтом экспериментальной медицины РАН.

Программы с подробным описанием дизайна исследования для всех вышеописанных направлений, утверждались комитетом биомедицинской этики Государственного научного центра Российской Федерации — Института медико-биологических проблем РАН, (Комиссия по биомедицинской этике ГНЦ РФ – Института медико-биологических проблем РАН /Физиологическая секция Российского Комитета по биоэтике при Комиссии РФ по делам ЮНЕСКО/протокол 643 от 7 июля 2023 г.

Все участники добровольно подписали информированное согласие на участие в исследовании и опубликование его результатов в научных целях в обезличенной форме.

 

 

Результаты исследований

 

Результаты исследований представлены на рисунке 1 и таблицах 2-5. На рисунке 1 видно, что показатели эубиотического индекса для микробиоты кишечника в опытной группе, использующей постбиотик, оказались значительно выше, чем у контрольной группы, не использующей постбиотик. Указанные изменения происходили главным образом из-за поддержания высоких концентраций бифидобактерий и лактобацилл.

Что касается эубиотического индекса, характеризующего микрофлору слизистых оболочек верхних дыхательных путей, можно также отметить, что показатели эубиотического индекса по микробиоте данного биотопа также существенно различались - в опытной группе они были значительно более высокими, в первую очередь за счет количественной редукции или эрадикации золотистого стафилококка.

 

 

 

 

Рисунок 1 Динамика показателей эубиотического индекса микробиоты кишечника и верхних дыхательных путей в эксперименте с изоляцией (p < 0,05)

 

 

 

 

Таблица 2. Состав основных представителей микробиоты испытателей в эксперименте с изоляцией (Lg КОЕ) (контроль)

 

Испытатель, микроорганизмы	Сутки эксперимента
	фон	*	14	*	30	*	60
1 контроль
E.coli	8	+	8	-	6	+	6
Staphylococcus sp.	5	+	3	-	3	-	3
Enterococcus	4	-	6	+	6	+	6
Enterobacter sp.	8	+	6	-	8	-	6
Clostridium	5	-	5	-	5	-	5
Bifidobacterium	8	+	8	-	7	-	7
Lactobacillus	8	-	6	+	7	+	8
Bacillus cereus	5	+	0	-	3	-	3
Дрожжи	0	+	5	+	0	+	0
2 контроль
E.coli	6	-	6	-	6	-	6
S.aureus	5	+	0	+	0	+	0
Staphylococcus sp.	0	-	3	-	3	-	3
Enterococcus	6	+	6	+	6	+	6
Enterobacter sp.	6	-	6	-	6	-	6
Clostridium	5	-	5	-	5	-	5
Bifidobacterium	8	+	8	+	8	+	8
Lactobacillus	8	+	8	+	8	+	8
Bacillus cereus	0	+	0	-	3	-	3
Дрожжи	0	+	0	-	5	-	5
3 контроль
E.coli	8	+	8	-	6	-	6
S.aureus	3	+	0	+	0	+	0
Staphylococcus sp.	5	+	3	-	3	-	3
Enterococcus	6	+	6	+	6	+	6
Enterobacter sp.	8	+	6	-	8	+	6
Clostridium	5	-	5	-	5	-	5
Bifidobacterium	8	+	8	+	8	+	8
Lactobacillus	7	+	7	+	7	+	7
Bacillus cereus	0	+	0	-	3	-	3
Позитивные изменения		20		11		13
Негативные изменения		8		17		15
Эубиотический индекс		2,5		0,6		0,9

• *- изменение микробиоты в динамике: «+» - положительные изменения, «-» - негативные изменения

 

 

 

 

Таблица 3. Состав основных представителей микробиоты испытателей в эксперименте с изоляцией (Lg КОЕ) (опыт)

Испытатель, микроорганизмы	Сутки эксперимента
	фон	*	14	*	30	*	60
4 Энтерококк
E.coli	6	+	6	+	6	+	6
S.aureus	5	+	0	+	0	+	0
Staphylococcus sp.	0	-	3	+	0	-	3
Enterococcus	8	-	6	+	6	+	6
Enterobacter sp.	6	-	8	+	6	+	6
Clostridium	5	-	5	-	5	-	5
Bifidobacterium	9	+	9	+	9	+	9
Lactobacillus	7	+	7	+	7	+	7
Bacillus cereus	0	+	0	-	3	-	3
5 Энтерококк
E.coli	8	+	8	-	6	+	6
S.aureus	5	+	0	+	0	+	0
Staphylococcus sp.	-	-	3	-	5	-	3
Enterococcus	6	+	6	+	6	+	6
Enterobacter sp.	8	+	6	+	6	-	6
Clostridium	5	-	5	-	5	-	5
Bifidobacterium	8	+	9	-	8	+	8
Lactobacillus	8	+	8	+	8	+	8
Bacillus cereus	0	+	-	-	3	-	3
6 Энтерококк
E.coli	6	+	6	+	6	+	6
S.aureus	0	-	2	+	0	+	0
Staphylococcus sp.	0	-	3	+	2	+	2
Enterococcus	6	+	6	+	6	+	6
Enterobacter sp.	8	+	6	+	4	+	4
Clostridium	5	-	5	-	5	-	5
Bifidobacterium	8	+	9	+	9	+	9
Lactobacillus	7	+	7	+	8	+	8
Позитивные изменения		17		18		18
Негативные изменения		9		8		8
Эубиотический индекс		1,8		2,3		2,3

• *- изменение микробиоты в динамике: «+» - положительные изменения, «-» - негативные изменения

 

 

 

 

 

 

 

 

Таблица 4   Состав основных представителей микробиоты слизистых оболочек верхних дыхательных путей в эксперименте с изоляцией  (Lg КОЕ) (контроль)

Испытатель1 Контроль. Сутки эксперимента
нос	микроорганизмы,	фон	*	14	*	30	*	60
	Staphylococcus spp	7	-	7	-	7	-	7
	Corynebacterium spp	4	-	0	-	0	+	5
	Streptococcus spp	0	-	4	+	0	=	0
	Enterococcus spp	0	+	0	-	7	+	0
глотка	Staphylococcus spp	2	+	0	+	0	-	3
	Streptococcus spp	4	+	0	+	0	-	6
	Streptococcus зеленящий	0	+	0	-	7	+	0
	Enterococcus spp	4	-	8	+	0	-	4
	Staphylococcus aureus	0	+	0	-	1	+	0
Испытатель 2  Контроль
нос	Staphylococcus spp	7	-	7	+	0	-	7
	Streptococcus spp	0	-	6	+	0	+	0
	Staphylococcus aureus	0	+	0	-	8	+	0
глотка	Staphylococcus spp	4	+	1	+	0	-	2
	Streptococcus spp	4	+	0	+	0	-	5
	Enterococcus spp	2	-	5	-	7	+	5
Испытатель 3 Контроль
нос	Staphylococcus spp	5	-	8	+	7	+	0
глотка	Streptococcus spp	5	+	0	+	0	-	3
	Enterococcus spp	2	-	7	-	7	+	6
	Bacillus cereus	0	-	1	-	7	+	0
	Staphylococcus spp	0	+	0	+	0	-	1
Позитивные изменения			6		10		9
Негативные изменения			10		9		9
Эубиотический индекс			0,6		0,7		1

*- изменение микробиоты в динамике: «+» - положительные изменения, «-» - негативные изменения

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Таблица 5   Состав основных представителей микробиоты слизистых оболочек верхних дыхательных путей в эксперименте с изоляцией  (Lg КОЕ) (контроль)

Испытатель 4 Энтерококк. Сутки эксперимента
биотоп	микроорганизмы	фон	*	14	*	30		*	60
нос	Staphylococcus spp	5	-	6	-	6		-	6
глотка	Streptococcus spp	3	+	0	+	0		-	4
	Enterococcus spp	1	+	3	-	6		+	2
	Streptococcus spp	0	+	0	+	0		-	4
Испытатель 5 Энтерококк
нос	Staphylococcus spp	5	+	0	-	5		-	5
	Corynebacterium spp	5	-	0	-	0		+	4
	Escherichia.coli	2	+	0	+	0		+	0
	Staphylococcus aureus	0	-	7	+	0		+	0
	Streptococcus spp	0	+	0	-	4		+	0
глотка	Streptococcus spp	4	+	0	+	0		-	6
	Streptococcus зеленящий	3	+	0	-	6		+
	Enterococcus spp	4	-	5	-	7		-	8
	Escherichia coli	1	+	0	+	0		+	0
	Bacillus spp.	2	+	0	+	0		+	0
	Staphylococcus aureus	0	+	0	-	1		+	0
Испытатель 6 Энтерококк
нос	Staphylococcus aureus	6	-	6	+		3	-	4
	Klebsiella spp.	2	+	0	+		0	+	0
глотка	Staphylococcus aureus	1	+	0	+		0	+	0
	Staphylococcus spp	4	+	0	+		0	+	0
	Enterococcus spp	3	+	2	-		8	+	4
	Streptococcus spp	0	-	4	+		0	-	4
Положительные изменения			15		12			13
Отрицательные изменения			6		9			8
Эубиотический индекс			2,5		1,3			1,6

*- изменение микробиоты в динамике: «+» - положительные изменения, «-» - негативные изменения

 

Представленные результаты свидетельствуют о нарастании позитивных сдвигов в составе микробиоты кишечника. Это проявляется главным образом в нарастании количества представителей протективных микроорганизмов - бифидобактерий, лактобацилл, и в ряде случаев, энтерококков на фоне численного угнетения энтеробактерий, стафилококков и дрожжей. Характеристики эубиотического индекса для верхних дыхательных путей представлены на рисунке 1. Изменение показателей не столь существенно, но можно отметить большую тенденцию к стабилизации показателей у опытной группы.

ОБСУЖДЕНИЕ

Освоение околоземного пространства, водных глубин и т.п. требует личного участия человека, деятельность которого осуществляется в условиях все возрастающих чрезвычайных эмоциональных и физических нагрузок. В экстремальных условиях нарушаются барьерные функции организма, связанные с нормальным функционированием кожи, кишечника и слизистых оболочек, непосредственно контактирующих с окружающей средой. Если воздействующие факторы, прямо или опосредованно влияющие на фиксацию, выживание и функционирование нормальной микрофлоры, по своей интенсивности превышают компенсаторные механизмы экосистемы макроорганизм-микрофлора, то они будут индуцировать микроэкологические нарушения, характер проявления, степень выраженности и длительность которых зависят от дозы и продолжительности воздействия. Способность противостоять повреждающим воздействиям зависит от многих условий, характеризующих состояния организма [5, 6]. Результаты обследования космонавтов, принимавших участие в космических полётах различной длительности, выявили признаки развития вторичного иммунодефицита и нарушения регуляторных механизмов. Реакция каждого индивидуума зависела от его генетического и иммунологического потенциала, состояния микробиоценоза. В условиях воздействия экстремальных факторов искусственно изменённой среды происходит не только снижение колонизационной резистентности, но и могут создаться условия для развития патологических процессов, оказывающих непосредственное влияние на работоспособность и состояние здоровья людей, находящихся в этих условиях.

Опыт проведённых исследований свидетельствует о развитии синдрома нарушения колонизационной резистентности практически во всех случаях использования человеком искусственно изменённой среды обитания [7]. При этом, определяющими для развития этого синдрома были как специфические факторы, т. е. факторы измененной среды обитания, так и неспецифические, предположительно, стрессиндуцированные факторы. Они воздействуют практически на все барьеры колонизации. Перечень экологически комплементарных человеку средств и методов укрепления барьеров колонизации можно и должно пополнить за счёт таких эффективных средств, как постбиотики, оценке эффективности которых была посвящена данная работа.

 

Заключение

Таким образом, впервые был создан и испытан препарат, содержащий пребиотик post mortem на основе энторококков, инактивированный в процессе выпечки хлеба. В продолжении использования этого продукта отмечалась стабилизация состава микробиоты кишечника главным образом за счет роста лактобацилл и бифидобактерий, сопровождающегося количественной редукцией энтеробактерий.

 

Таким образом, впервые был создан и испытан препарат, содержащий пребиотик на основе штамма пробиотического энторококков, инактивированного в процессе выпечки хлеба. Позитивные эффекты вляния постбиотика на эубиотический индекс могут быть связаны с наличием в конечном продукте энтерококковых продуктов, в первую очередь, антимикробных пептидов, обладающих термостойкостью.

В эксперименте, предусматривающем включение в рацион питания испытателей хлеба с добавлением постбиотика, отмечалась стабилизация состава микробиоты кишечника, главным образом за счет роста лактобацилл и бифидобактерий, сопровождающегося количественной редукцией энтеробактерий.

 

About the authors

Vyacheslav Ilyin

Email: piton2004@bk.ru
ORCID iD: 0000-0003-3896-5003

Aleksandr Suvorov

Email: a.n.suvorov@spbu.ru
ORCID iD: 0000-0003-2312-5589

Marina Kostyuchenko

Email: m.kostyuchenko@gosniihp.ru
ORCID iD: 0000-0001-7854-3513

Vladimir Martirosian

Email: v.martirosyan@gosniihp.ru
ORCID iD: 0000-0002-4026-5789

Olga Tyurina

Email: oeturina@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-6662-7530

Marina Nosova

Email: m.nosova@gosniihp.ru

Nonna Usanova

Email: usanova@imbp.ru
ORCID iD: 0000-0002-8485-4470

Julia Morozova

Email: morozova@imbp.ru
ORCID iD: 0000-0002-9461-6986

Galina Alyohina

Email: a.n.suvorov@spbu.ru

Liubov Starkova

Email: starkova@imbp.ru
ORCID iD: 0000-0001-9540-4769

Angelica Parfenova

Email: angelikaparfenova3@gmail.com

Igor Vilenskii

Email: medosmotr26@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-6065-2295

Elena Alieva

Federal State Budgetary Educational Institution of Additional Professional Education “Russian Medical Academy of Continuous Professional Education” of the Ministry of Health of the Russian Federation

Author for correspondence.
Email: elalieva.ru@mail.ru
ORCID iD: 0009-0007-1349-9882
SPIN-code: 9126-1010

Professor of the Department of Medical Microbiology named after Academician Z.V. Ermolyeva

Russian Federation

References

Supplementary files