Antibacterial activity of sodium pentosan polysulfate against uropathogenic microorganisms

Full Text

ОБОСНОВАНИЕ

Нарушения мочеиспускания являются одними из ведущих жалоб больных урологического профиля. Основными причинами дизурии у женщин являются инфекционные поражения мочевого пузыря, гиперактивный мочевой пузырь и синдром болезненного мочевого пузыря/интерстициальный цистит [1]. В патогенезе указанных заболеваний важное значение придается нарушению функции уротелия.

Уротелий представляет собой не просто механическое препятствие, не позволяющее проникать в стенку мочевого пузыря инфекционным агентам, растворенным веществам в моче или токсинам; в настоящее время он признан специализированной тканью, регулирующей сложную функцию мочевого пузыря и играющую важную роль в развитии его заболеваний [2, 3]. Уротелиальный барьер образуют плотно соединенные между собой уротелиоциты, гидрофобные бляшки уроплакина и гликозаминогликановый (ГАГ) слой [4]. При нарушении барьерной функции уротелия в подслизистом слое мочевого пузыря развивается асептическое воспаление, приводящее к усилению чувствительности мочевого пузыря с появлением гиперсенсорных нарушений, которые проявляются гиперактивным мочевым пузырем и синдромом болезненного мочевого пузыря, а при присоединении инфекции развивается цистит [5, 6].

В осуществлении барьерной функции уротелия важная роль придается ГАГ-слою, образованному отрицательно заряженными гетерогенными полисахаридами, состоящими из разного количества повторяющихся дисахаридных единиц. Выделяют два класса ГАГ: несульфатированные ГАГ - гиалуроновая кислота (ГК) и сульфатированные ГАГ (гепарансульфат (ГС) гепарин, хондроитинсульфат (ХС), дерматансульфат и кератансульфат). [7] За исключением ГК, все ГАГ ковалентно связаны с белками, образуя протеогликаны [8]. Последние в большом количестве присутствуют на поверхности уротелия мочевого пузыря [9].

С 1975 года роль ГАГ в барьерной функции мочевого пузыря активно изучал проф. C. L. Parsons [10]. В 1977 г. его исследовательская группа в эксперименте доказали, что полисахариды на поверхности уротелия обладают антибактериальными свойствами [11]. В 1979 г. C. L. Parsons и соавторы в исследованиях на животных продемонстрировали, что экзогенное введение гепарина в мочевой пузырь, лишённый ГАГ, восстанавливает его антибактериальные свойства [12].

Пентозана полисульфат натрия (ППH) - полусинтетический ГАГ, имеющий химические и структурные сходства с ГАГ природного происхождения [13]. При пероральном приеме ППН экскретируется с мочой, при этом его молекулы способны прикрепляться к слизистой оболочке стенки мочевого пузыря и создавать своеобразный барьер, регулирующий клеточную проницаемость. Он замещает поврежденный слой слизистого уротелия и препятствует контакту эпителия слизистой оболочки мочевого пузыря с различными агрессивными веществами, растворенными в моче. Также он препятствует прилипанию бактерий к внутренней поверхности мочевого пузыря [14, 15].

Антиадгезивные свойства ППН были продемонстрированы и в отношении вируса SARS-CoV-2 в экспериментальных исследованиях [16]. На модели животных было показано возможное антибактериальное действие ППН при внутрипузырном его введении благодаря связыванию с эпителием мочевого пузыря в виде коллоидной суспензии [17]. При этом ППН достаточно прочно связывается с уроэпителием мочевого пузыря [18]. Таким образом, ППН эффективно восстанавливает барьерную функцию эпителия в мочевом пузыре с дефицитом ГАГ. 

Как известно, основными возбудителями инфекций нижних мочевыводящих путей (ИНМП) являются Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Enterococcus faecalis [19]. В связи с широким использованием антибактериальных препаратов многие штаммы перечисленных бактерий приобретают устойчивость к антибиотикам. В таких условиях поиск препаратов, препятствующих адгезии как чувствительных, так и устойчивых штаммов бактерий, на клетках слизистого эпителия мочевого пузыря является очень важным.

 

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Материалом для исследования явились изоляты микроорганизмов, выделенных из средней порции мочи женщин с рецидивирующими ИНМП. Критериями включения в настоящее исследование были женский пол, возраст 18 лет и старше, давность заболевания не менее трех лет и наличие обострения цистита к началу исследования. Последнее диагностировали на основании жалоб, клинической картины, а также результатов общего анализа мочи (более 10 лейкоцитов в 1 мкл мочи). Идентификация была выполнена с использованием классических бактериологических методов и масс-спектрометрического метода (MALDI-TOF). Для эксперимента были отобраны штаммы E. coli, K. pneumoniae, E. faecalis (по 3 штамма каждого вида).

Методы исследования: классический бактериологический, микроскопический, экспериментальный (адгезия на клетках буккального эпителия) [20].

         РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1. Исследование антибактериальной активности пентозана полисульфата натрия в динамике.

Готовили бактериальную суспензию 0,5 MF из суточных культур, выросших на плотной питательной среде. Путем разведения в мясопептонном бульоне (МПБ) получали суспензии, содержащие 10⁶ КОЕ/мл. ППН растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО) и стерильной дистилированной воде (70%/30%). К 1 мл бактериальных суспензий добавляли 1 мл раствора ППН в концентрации 1 мг/мл (по 3 пробирки на каждый штамм бактерий). Контролем служила бактериальная суспензия, разведенная в 2 раза стерильным физиологическим раствором (тоже по 3 пробирки на каждый штамм бактерий). Сразу же производили высев газоном с помощью шпателя из пробирок по 10 мкл суспензий на чашки Петри с плотной питательной средой: мясопептонным агаром (для E. coli и K. pneumoniae) и кровяным агаром (для E. faecalis). Посевы помещали в термостат на 24 часа при 37°C. Опытные и контрольные пробирки также помещали в термостат при 37°C. Далее каждые 3 часа производили высевы из пробирок до 15 часов экспозиции (3, 6, 9, 12, 15 часов) и окончательный высев через 24 часа. Через 24 часа экспозиции чашек Петри с высевами производили подсчет выросших колоний и вносили данные в таблицу результатов. Находили средние значения, отклонения и делали выводы. Графические результаты представлены на рисунке 1.

Рисунок 1

В результате оказалось, что в присутствии ППН количество бактерий в экспериментальных чашках оставалось стабильно низким до 15 часов. Затем отмечался рост, хотя и значительно ниже, чем в контролях.

2. Исследование антиадгезивных свойств пентозана полисульфата натрия на клетках буккального эпителия.

Буккальный эпителий отбирали с внутренней поверхности щеки здорового донора шпателем после промывания рта стерильным физиологическим раствором. Далее клетки суспендировали в стерильном физиологическом растворе. После проводили трехкратное промывание клеток: центрифугировали 10 минут при скорости 10000 об/мин, отбирали супернатант, осадок ресуспендировали в свежем стерильном физиологическом растворе и повторяли процедуру еще 2 раза. Далее на экспериментальные и контрольные стерильные предметные стекла наносили по 100 мкл клеток буккального эпителия, помещали их во влажную камеру в термостат при 37°C.

После подсыхания (примерно через 3 часа) на поверхность экспериментальных стекол наносили по 100 мкл раствора ППН в концентрации 1 мг/мл, распределяли по поверхности клеток и помещали в термостат. Выдерживали 30 минут в термостате, затем излишки сливали. Далее на поверхность всех стекол наносили по 100 мкл бактериальной суспензии, содержащей 10⁶ КОЕ/мл микроорганизмов. Все стекла помещали во влажную камеру в термостат при 37°C на 24 часа.

На следующий день после отмывки физиологическим раствором половину стекол окрашивали по Граму и просматривали под обычным световым микроскопом при увеличении в 400 раз, оставшуюся половину окрашивали флуоресцентным красителем DAPI и изучали в люминесцентном микроскопе при увеличении в 400 раз. Подсчитывали количество прикрепившихся бактерий к клеткам буккального эпителия на всех стеклах, регистрировали, подсчитывали среднее значение и стандартное отклонение (табл.1).

Таблица 1

Фото результатов представлены на рисунках 2 – 7.

Рисунок 2

Рисунок 3

Рисунок 4

Рисунок 5

Рисунок 6

Рисунок 7

3. Исследование антибиопленочных свойств пентозана полисульфата натрия в планшетах по оптической плотности

Для получения моделей биопленок использовали метод культивирования в 96-луночных плоскодонных полистироловых планшетах. В рамках каждого эксперимента делали положительный контроль, отрицательный контроль и опытные образцы.

В качестве положительного контроля (3 повторности) использовали взвесь микроорганизмов в концентрации 10⁶ КОЕ/мл и МПБ в соотношении 1:1. В качестве отрицательного контроля (3 повторности) использовали стерильный физиологический раствор, использовавшийся для приготовления взвесей микроорганизмов, и МПБ в соотношении 1:1.

В экспериментальные лунки планшетов вносили ППН в количестве 10 мкл, в контрольные лунки вносили по 10 мкл стерильной дистиллированной воды. После подсыхания растворов во все лунки вносили МПБ и взвесь микроорганизмов в соотношении 1:1. Планшеты ставили в термостат на 24 часа при 37°С.

Для учета результатов использовали метод окрашивания биопленок генциановым фиолетовым. После завершения инкубации из лунок полностью удаляли всю жидкость и промывали планшеты для удаления оставшихся планктонных клеток. Планшеты сушили, и из одной лунки каждого ряда делали высев на плотную питательную среду для определения наличия жизнеспособных клеток в полученной биопленке. В остальные лунки вносили краситель генциановый фиолетовый в объеме культивирования на 15 минут. По истечении времени планшеты промывали от несвязавшегося красителя и оставляли до полного высыхания. Для элюирования красителя использовали уксусную кислоту в концентрации 30%, которую вносили в окрашенные лунки на 15 минут, после чего удаляли и измеряли оптическую плотность при 490 нм. Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2

 

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Результаты микробиологического исследования показали, что ППН обладает антимикробной активностью в отношении основных уропатогенов.

Антибактериальное действие ППН при совместном культивировании с бактериями – основными возбудителями ИНМП - отмечается в течение 15 часов, как для грамположительных, так и грамотрицательных микроорганизмов. При рекомендуемом графике приема ППН 3 раза в сутки, то есть каждые 8 часов, и известном эффекте накопления препарата [21] можно ожидать пролонгированный устойчивый эффект от применения ППН. 

         Антиадгезивные свойства ППН наиболее выражены в отношении E. faecalis: в присутствии ППН количество адгезированных к клеткам буккального эпителия бактерий уменьшилось в 3,7 раза. Несколько меньшая эффективность отмечена в отношении E. coli: индекс адгезии снижался в 3,3 раза. Наименьшее снижение индекса адгезии наблюдалось в отношении K. pneumoniae – в 2,6 раза. Возможно, это связано с наличием у этих бактерий выраженной капсулы. Тем не менее все результаты указывают на значительное антиадгезивное действие ППН.

         Поскольку в организме человека бактерии часто находятся в составе биопленок, что особенно характерно для ИНМП, то антибиопленочные свойства ППН являются очень ценным аргументом в пользу целесообразности его применения. Так, плотность формирующейся биопленки из E. coli на поверхности ППН была в 1,7 раза меньше, чем без ППН. Плотность биопленки из E. faecalis в присутствии ППН снижалась в 1,6 раза. Бактерии K. pneumoniae формировали биопленку в 1,2 раза менее плотную на поверхности ППН. Можно предположить, что химическая структура ППН в меньшей степени может воздействовать на капсульные микроорганизмы, хотя положительное действие имеет место. Таким образом, полученные нами результаты подтверждают возможность повышения эффективности терапии ИНМП, особенно связанных с микробной биопленкой.

Ранее ППН применялся в виде монотерапии в течение 16 недель у женщин с рецидивирующими ИНМП с хорошим клиническим эффектом. Через два года после завершения исследования частота рецидивов ИНМП составила 25% в группе с использованием ППН и 85,7% - в контрольной группе. [22]. Проведенное нами микробиологическое исследование позволило раскрыть механизмы антибактериальной активности ППН в отношении уропатогенов и определить ряд важных количественных параметров его эффектов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Проведенное исследование in vitro позволило установить и количественно оценить выраженность антибактериального, антиадгезивного и антибиопленочного эффекта ППН в отношении уропатогенных микрорганизмов, выделенных из мочи пациентов с рецидивирующими ИНМП.

About the authors

Ludmila Kraeva

Saint-Petersburg Pasteur Institute;
Military Medical Academy named after S.M. Kirov

Author for correspondence.
Email: lykraeva@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-9115-3250
SPIN-code: 4863-4001
Scopus Author ID: 23473821900
ResearcherId: H-1786-2012
https://www.pasteurorg.ru/article/265/2400/Kraeva-Lyudmila-Aleksandrovna

Аssociate Professor, Doctor of Medical Sciences, Head of the Laboratory of Medical Bacteriology

Russian Federation, 197101, Russia, St. Petersburg, Mira St., 14; 6 Akademika Lebedeva str., Saint Petersburg, 194044

Elena Victorovna Smirnova

Center of Hygiene and Epidemiology in St. Petersburg and Leningrad region

Email: elenasmirno@yandex.ru

Head of the Bacteriological Laboratory

Russian Federation, St. Petersburg, Karpinsky street, 27

Anatoliy Karpovich Tokmalaev

Patrice Lumumba Peoples' Friendship University of Russia

Email: tokmalaev39@mail.ru
SPIN-code: 1650-0831

Professor, Doctor of Medical Sciences, Department of Infectious Diseases with courses in Epidemiology and Phthisiology

Russian Federation, 6 Miklukho-Maklaya str., Moscow, 117198

Margarita Nikolaevna Slesarevskaya

Pavlov St. Petersburg State Medical University

Email: mns-1971@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-4911-6018
SPIN-code: 9602-7775

PhD, Senior Researcher at the Research Institute of Urology, Research Institute of Surgery and Emergency Medicine

Russian Federation, 6-8 Lva Tolstogo str., Saint Petersburg, 197022.

Igor Valentinovich Kuzmin

Pavlov St. Petersburg State Medical University

Email: kuzminigor@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-7724-7832
SPIN-code: 2684-4070
Scopus Author ID: 56878681300

MD, Professor of the Department of Urology

Russian Federation, 6-8 Lva Tolstogo str., Saint Petersburg, 197022

References

Supplementary files