Comparative profile of T-cell Subpopulations in patients with moderate and severe COVID-19

Full Text

ОБОСНОВАНИЕ

Пандемия COVID-19, вызванная коронавирусом тяжёлого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2), характеризуется широким спектром клинических проявлений — от бессимптомного носительства до критических состояний, сопровождающихся острым респираторным дистресс-синдромом и полиорганной недостаточностью [1]. Одним из центральных патогенетических механизмов, определяющих тяжесть заболевания, является дисрегуляция иммунного ответа, в которой ключевую роль играют адаптивные иммунные реакции, опосредованные Т-лимфоцитами [2].

Т-клетки не только обеспечивают прямую цитотоксичность против инфицированных клеток (CD8⁺-цитотоксические лимфоциты), но и координируют работу других звеньев иммунитета через CD4⁺-хелперные лимфоциты. Нарушение их функций, количества и соотношения различных субпопуляций напрямую связано с неспособностью организма контролировать репликацию вируса и предотвращать развитие гипервоспаления, известного как «цитокиновый шторм» [3]. Многочисленные исследования показали выраженную лимфопению как универсальный признак тяжёлого течения COVID-19, однако характер изменений внутри Т-клеточной популяции требует детального сравнительного анализа [4].

Исследования последних лет выявили специфические закономерности иммунной дисфункции. У пациентов с тяжёлыми формами COVID-19 наблюдают не просто снижение общего количества Т-лимфоцитов (CD3⁺), но и избирательное истощение CD4⁺- и CD8⁺-субпопуляций, что коррелирует с неблагоприятным прогнозом [5, 6]. Кроме того, появляется всё больше данных о нарушении регуляторных механизмов. Так, дисбаланс в соотношении T-хелперов, в частности снижение количества регуляторных Т-клеток, которые контролируют чрезмерный иммунный ответ, и одновременная активация провоспалительных субпопуляций могут вносить значительный вклад в повреждение лёгочной ткани и развитие системного воспаления [7, 8].

Важным аспектом является также феномен T-клеточного истощения, который характеризуется повышенной экспрессией ингибиторных рецепторов, таких как PD-1, TIM-3 и LAG-3, на поверхности T-лимфоцитов у пациентов в критическом состоянии [9, 10]. Этот компенсаторный механизм, направленный на ограничение повреждения тканей, может одновременно приводить к неспособности эффективно элиминировать вирус.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Провести сравнительный анализ абсолютного количества основных субпопуляций Т-лимфоцитов (CD3⁺, CD4⁺, CD8⁺) и их соотношения у пациентов со среднетяжёлой и тяжёлой формами COVID-19 для выявления иммунологических маркеров, ассоциированных с прогрессированием заболевания.

МЕТОДЫ

Дизайн исследования

Проведено одноцентровое, сравнительное, наблюдательное исследование на базе госпитальной выборки. Исследование имело одномоментный дизайн с формированием двух независимых групп пациентов по степени тяжести заболевания на момент включения. Выборка участников была нерандомизированной: в исследование последовательно включали всех госпитализированных пациентов, которые соответствовали критериям отбора.

Условия проведения исследования

Исследование проведено на базе учреждения здравоохранения «Городская клиническая инфекционная больница» и отделения реанимации и интенсивной терапии учреждения здравоохранения «5-я городская клиническая больница» (г. Минск, Республика Беларусь). Забор образцов периферической крови и лабораторные исследования выполняли в ноябре–декабре 2021 года. Все измерения и оценку клинического статуса пациентов производили в период госпитализации.

Критерии соответствия (отбора)

Критерии включения:

• возраст ≥18 лет;
• госпитализация в период проведения исследования;
• лабораторно подтверждённая инфекция SARS-CoV-2 методом полимеразной цепной реакции;
• наличие добровольного информированного согласия пациента или его законного представителя на включение в исследование и использование обезличенных медицинских данных в научных целях, включая публикацию.

Критерии невключения:

• лёгкая (амбулаторная) форма COVID-19;
• наличие в анамнезе онкологических заболеваний, ВИЧ-инфекции, других первичных или вторичных иммунодефицитных состояний, а также получаемая иммуносупрессивная терапия;
• отсутствие добровольного информированного согласия пациента или его законного представителя на участие в исследовании.

Критерии исключения:

• неприменимо (все включённые пациенты, предоставившие согласие, были проанализированы).

Подбор участников в группы

Пациенты были разделены на две группы на основании клинической картины и необходимости респираторной поддержки на момент забора крови:

• группа 1 (среднетяжёлое течение, n=66): пациенты, не требующие перевода в отделение реанимации и искусственной вентиляции лёгких (ИВЛ);
• группа 2 (тяжёлое течение, n=23): пациенты, находящиеся на ИВЛ в связи с развитием острой дыхательной недостаточности.

Формирование групп по каким-либо иным характеристикам (возраст, пол, сопутствующие заболевания) не проводили. Группы были собраны исключительно на основе различий в тяжести состояния (клиническом исходе), что соответствует дизайну сравнительного исследования.

ЦЕЛЕВЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Основной показатель исследования

В качестве основного показателя оценивали абсолютное количество CD4⁺ и CD8⁺ Т-лимфоцитов в периферической крови у пациентов с COVID-19 в зависимости от тяжести течения заболевания.

Дополнительные показатели исследования

Дополнительными показателями исследования служили соотношение CD4⁺/CD8⁺ (иммунорегуляторный индекс) и общая оценка выраженности лимфопении, основанная на абсолютных значениях основных субпопуляций лимфоцитов.

Методы измерения целевых показателей

Забор периферической венозной крови (объём 4 мл) осуществляли в вакуумные пробирки с этилендиаминтетрауксусной кислотой (К₂ЭДТА). В течение 2 ч после взятия образца проводили иммунофенотипирование методом проточной цитометрии на цитофлуориметре BD FACS Calibur (Becton Dickinson, США). Использовали коммерческий набор моноклональных антител BD Multitest™ CD3FITC/CD8PE/CD45PerCP/CD4APC (Becton Dickinson, США) в соответствии с инструкцией производителя. Данный набор позволяет определить процентное содержание и абсолютное количество лимфоцитов, экспрессирующих маркёры CD3⁺ (зрелые Т-лимфоциты), CD3⁺CD4⁺ (Т-хелперы) и CD3⁺CD8⁺ (цитотоксические Т-лимфоциты). Абсолютное количество клеток рассчитывали автоматически программным обеспечением прибора на основе известного количества событий в заданном объёме.

Анализ чувствительности

Анализ чувствительности для оценки устойчивости результатов к изменениям исходных условий (например, при исключении выбросов или использовании иных пороговых значений) в рамках данного исследования не проводили.

Статистические процедуры

Запланированный размер выборки

Предварительный расчёт объёма выборки не проводили. Исследование носило поисковый характер, в него были включены все последовательно госпитализированные пациенты, соответствующие критериям, в установленный период (ноябрь–декабрь 2021 г.).

Статистические методы

Статистическую обработку данных проводили с использованием программной среды R (R Foundation for Statistical Computing, Австрия). Характер распределения количественных переменных проверяли с помощью критерия Шапиро–Уилка. Поскольку распределение отличалось от нормального, данные представлены в виде Me [Q1; Q3], где Me — медиана, Q1 и Q3 — 25-й и 75-й процентиль соответственно. Для сравнения показателей между двумя независимыми группами использовали непараметрический U-критерий Манна–Уитни. Статистически значимыми считали различия при уровне p <0,05 (p-значения представлены с точностью до третьего знака после запятой).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Формирование выборки

Всего в период с ноября по декабрь 2021 года было госпитализировано 102 пациента с подтверждённой инфекцией COVID-19, соответствовавших критериям включения в исследование. Из них 13 пациентов были исключены в соответствии с критериями невключения (наличие онкологических заболеваний/иммуносупрессии). Таким образом, в окончательный анализ вошли 89 пациентов, которых разделили на группы со среднетяжёлым (n=66) и тяжёлым (n=23) течением заболевания.

Характеристики выборки

Сравнение групп по основным демографическим характеристикам представлено в табл. 1. Группы были сопоставимы по полу и возрасту (p >0,05), что минимизирует потенциальное влияние этих факторов на различия в иммунологических показателях.

 

Таблица 1. Сравнение групп по исходным характеристикам

Показатель	Среднетяжёлое течение (n=66)	Тяжёлое течение (n=23)	p
Возраст, годы, Ме [Q1; Q3]	58 [49; 67]	62 [55; 70]	0,154*
Мужской пол, n (%)	35 (53,0%)	14 (60,9%)	0,521**

Примечание: * — U-критерий Манна–Уитни, ** — критерий χ², Me — медиана, Q1 и Q3 — 25-й и 75-й процентиль соответственно.

 

Основные результаты исследования

Данные первоначального анализа показали, что общее количество лимфоцитов у пациентов в критическом состоянии было достоверно ниже, чем у пациентов со среднетяжёлым течением. Однако для детальной характеристики иммунологических нарушений провели сравнительный анализ абсолютного количества и соотношения основных субпопуляций Т-лимфоцитов. Результаты статистической обработки представлены в табл. 2.

 

Таблица 2. Сравнительная характеристика показателей клеточного иммунитета у пациентов с COVID-19

Показатель	Среднетяжёлое течение (n=66), Ме [Q1; Q3]	Тяжёлое течение (n=23), Ме [Q1; Q3]	p
CD4+-лимфоциты (кл/мкл)	750 [470; 1061]	222 [135; 446]	<0,001*
CD8+-лимфоциты (кл/мкл)	337 [238; 444]	98 [72; 275]	<0,001*
Соотношение CD4+/CD8+	2,09 [1, 61; 3, 21]	1,64 [1, 30; 2, 31]	0,073

Примечание: * — статистически значимые различия (p <0,05) по U-критерию Манна–Уитни, Me — медиана, Q1 и Q3 — 25-й и 75-й процентиль соответственно.

 

Наиболее выраженные изменения затронули пул CD4⁺-лимфоцитов. В группе пациентов с тяжёлым течением COVID-19 зафиксировали критическое снижение абсолютного количества CD4⁺-клеток. Медианное значение в этой группе составило 222 [135; 446] кл/мкл, что более чем в 3 раза ниже, чем в группе со среднетяжёлым течением, где медиана равнялась 750 [470; 1061] кл/мкл (рис. 1). Статистическая значимость данного различия была чрезвычайно высокой (p=1,05e^-06), что подчёркивает выраженность дефицита именно этой субпопуляции при прогрессировании заболевания.

 

Рис. 1. Абсолютное количество CD4⁺-лимфоцитов у пациентов с разной тяжестью течения COVID-19. Синим цветом обозначена группа со среднетяжёлым течением, красным — с тяжёлым. Показаны медиана и интерквартильный размах. Уровень статистической значимости различий: p <0,001.

 

Аналогичную, хотя и несколько менее выраженную, динамику наблюдали для CD8⁺-лимфоцитов. У пациентов на ИВЛ медианное количество цитотоксических Т-лимфоцитов составило 98 [72; 275] кл/мкл, что также в несколько раз ниже, чем в группе сравнения (337 [238; 444] кл/мкл) (рис. 2). Различия между группами были статистически значимы (p=0,00036). Это указывает на то, что тяжёлое течение COVID-19 ассоциировано не только с глубокой Т-хелперной, но и с выраженной цитотоксической лимфопенией.

 

Рис. 2. Абсолютное количество CD8⁺-лимфоцитов у пациентов с разной тяжестью течения COVID-19. Синим цветом обозначена группа со среднетяжёлым течением, красным — с тяжёлым. Показаны медиана и интерквартильный размах. Уровень статистической значимости различий: p <0,001.

 

Оценка баланса между основными субпопуляциями показала, что соотношение CD4⁺/CD8⁺ имело тенденцию к снижению в группе с тяжёлым течением (медиана 1,64) по сравнению с группой среднетяжёлого течения (медиана 2,09) (рис. 3). Однако эта разница не достигла уровня статистической значимости (p=0,073). Это позволяет предположить, что при тяжёлой форме COVID-19 происходит пропорциональное угнетение как хелперного, так и цитотоксического звена адаптивного иммунитета, не приводящее к кардинальному сдвигу иммунорегуляторного индекса.

 

Рис. 3. Соотношение CD4⁺/CD8⁺ лимфоцитов у пациентов с разной тяжестью течения COVID-19. Синим цветом обозначена группа со среднетяжёлым течением, красным — с тяжёлым.

 

Проведённый анализ демонстрирует чёткую зависимость между степенью лимфопении и тяжестью клинического состояния пациентов с COVID-19. Наибольшее снижение было характерно для пула CD4⁺-лимфоцитов, что может иметь ключевое значение в нарушении координации адаптивного иммунного ответа. Таким образом, абсолютные значения CD4⁺- и CD8⁺-лимфоцитов могут служить объективными лабораторными маркёрами, количественно отражающими степень угнетения клеточного иммунитета при инфекции, вызванной SARS-CoV-2.

ОБСУЖДЕНИЕ

Резюме основного результата исследования

Полученные результаты свидетельствуют о том, что тяжёлая форма COVID-19 характеризуется развитием глубокой иммунной дисфункции. Это проявляется значительным и достоверным снижением абсолютного количества основных субпопуляций Т-лимфоцитов — CD4⁺- и CD8⁺-клеток — по сравнению со среднетяжёлой формой заболевания.

Ограничения исследования

• Ограничения, связанные с выборкой. Исследование является одноцентровым с относительно небольшим объёмом выборки, особенно в группе пациентов с тяжёлой формой (n=23), что ограничивает статистическую мощность анализа. Предварительный расчёт размера выборки не выполняли. Рандомизацию групп не проводили, однако группы были сопоставимы по базовым демографическим характеристикам.
• Ограничения, связанные с сопоставимостью групп. Формирование групп по принципу наличия/отсутствия тяжёлого исхода (потребность в ИВЛ) на момент включения соответствует дизайну одномоментного исследования. Такой дизайн не позволяет установить причинно-следственную связь: является ли выявленная лимфопения причиной или следствием критического состояния.
• Ограничения, связанные с оцениваемыми показателями исследования. В исследовании анализировали только количественные изменения основных субпопуляций Т-лимфоцитов. Оценки функциональной активности (пролиферацию, цитокин-продуцирующую способность, феномен истощения), субпопуляций регуляторных T-клеток, а также специфичного к SARS-CoV-2 Т-клеточного ответа не проводили, что ограничивает глубину патофизиологической интерпретации результатов.
• Ограничения, связанные с методами измерения. Использование проточной цитометрии является стандартным высокоточным методом. Однако обсервационный характер исследования и забор крови в рамках рутинной клинической практики могли стать причиной неконтролируемых вариаций.

Интерпретация результатов исследования

Полученные результаты согласуются с данными других авторов, которые также отмечали выраженное снижение CD4⁺ и CD8⁺ Т-клеток при тяжёлом течении COVID-19 [5, 7]. Новизна данного исследования заключается в демонстрации пропорционального характера данного снижения (соотношение CD4⁺/CD8⁺ остаётся неизменным). Это указывает на глобальное угнетение Т-клеточного звена иммунитета, а не на избирательный перекос в сторону одной из субпопуляций. Результаты подтверждают гипотезу о ключевой роли общего Т-клеточного дефицита, а не только дисбаланса субпопуляций, в патогенезе тяжёлых форм заболевания [3]. Наиболее выраженное снижение пула CD4⁺ Т-лимфоцитов может объяснять нарушение координации адаптивного иммунного ответа и потерю контроля над вирусной репликацией, что согласуется с концепцией вторичного иммунодефицита при критических состояниях

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведённого одноцентрового сравнительного исследования субпопуляционного состава Т-лимфоцитов у пациентов с COVID-19 в зависимости от тяжести течения заболевания получили данные, которые расширяют представления о механизмах развития тяжёлых форм COVID-19. Подтвердили связь глубины лимфопении с тяжестью клинического течения. У пациентов с тяжёлой формой COVID-19, находящихся на ИВЛ, выявили достоверное и выраженное снижение абсолютного количества основных субпопуляций Т-лимфоцитов по сравнению с пациентами со среднетяжёлым течением. Определили характерную структуру иммунной дисфункции. Установили, что тяжёлое течение заболевания ассоциировано не с изолированным, а с сочетанным угнетением как хелперного (CD4⁺), так и цитотоксического (CD8⁺) звеньев клеточного иммунитета. При этом наиболее существенное снижение (более чем в 3 раза) наблюдали в пуле CD4⁺-лимфоцитов, что может указывать на ключевую роль дефицита Т-хелперов в нарушении координации адаптивного иммунного ответа. Определили потенциальный лабораторный маркёр тяжести состояния. Абсолютное количество CD4⁺- и CD8⁺-лимфоцитов может служить количественным иммунологическим маркёром для стратификации риска и оценки прогноза у госпитализированных пациентов с COVID-19. Обнаружили специфику иммунного дисбаланса. Отсутствие статистически значимого изменения иммунорегуляторного индекса CD4⁺/CD8⁺ свидетельствует о пропорциональном снижении основных субпопуляций Т-клеток. Это указывает на то, что ключевым патогенетическим механизмом является глобальное угнетение Т-клеточного звена, а не избирательный дисбаланс в сторону одного из субпопуляций.

Полученные результаты вносят вклад в понимание иммунопатогенеза COVID-19, подтверждая центральную роль глубокой Т-клеточной лимфопении в прогрессировании заболевания. В практическом здравоохранении данные нашего исследования обосновывают целесообразность мониторинга субпопуляционного состава лимфоцитов (особенно абсолютного количества CD4⁺- и CD8⁺-клеток) для раннего выявления пациентов с высоким риском развития тяжёлых осложнений. Это может способствовать своевременному назначению усиленной иммунотропной или противовоспалительной терапии.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. Л.А. Анисько — концепция и дизайн исследования, сбор и обработка материала, статистический анализ данных, написание и редактирование рукописи; И.А. Карпов — концепция и дизайн исследования, контроль проведения исследования, интерпретация данных, редактирование рукописи. Все авторы одобрили финальную версию рукописи, а также согласились нести ответственность за все аспекты настоящей работы, гарантируют надлежащее рассмотрение и решение вопросов, связанных с точностью и добросовестностью любой её части.

Благодарности. Авторы выражают благодарность коллективам клинических отделений учреждения здравоохранения «Городская клиническая инфекционная больница» и учреждения здравоохранения «5-я городская клиническая больница» г. Минска за помощь в организации исследования.

Этическая экспертиза. Исследование одобрено локальными этическим комитетом учреждения здравоохранения «Городская клиническая инфекционная больница» (протокол № 1 от 12.02.2021).

Источники финансирования. Исследование не имело целевого финансирования. Затраты на проведение проточной цитометрии были покрыты за счёт средств учреждения в рамках рутинной диагностики. Спонсоры не участвовали в разработке дизайна исследования, сборе, анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Раскрытие интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов, финансового или иного, который мог бы повлиять на объективность представленных результатов или их интерпретацию.

Заявление об оригинальности. Авторы заявляют, что представленная рукопись является оригинальной работой. Все данные, представленные в статье, были собраны и проанализированы авторами впервые для целей данного исследования. Заимствование ранее опубликованных данных, текста или иллюстраций у других авторов не осуществлялось.

Доступ к данным. Редакционная политика журнала по вопросам доступа к данным к настоящей работе неприменима.

Генеративный искусственный интеллект. В процессе подготовки или редактирования данной рукописи генеративный искусственный интеллект не использовался.

Рассмотрение и рецензирование. Рукопись направлена в редакцию журнала в инициативном порядке и рассмотрена по обычной процедуре. В рецензировании участвовали два члена редакционной коллегии журнала.

ADDITIONAL INFORMATION

Author contributions: L.A. Anisko: conceptualization, investigation, formal analysis, writing—original draft, writing—review & editing; I.A. Karpov: conceptualization, supervision, formal analysis, writing—review & editing. All the authors approved the version of the manuscript to be published and agreed to be accountable for all aspects of the work, ensuring that questions related to the accuracy or integrity of any part of the work are appropriately investigated and resolved.

Acknowledgments: The authors express their gratitude to the clinical department teams at the City Clinical Infectious Diseases Hospital and the 5th City Clinical Hospital in Minsk for their assistance with organizing the study.

Ethics approval: The study was approved by the Local Ethics Committee of the City Clinical Infectious Diseases Hospital (Minutes No. 1 dated February 12, 2021).

Funding sources: The study did not receive any targeted funding. The hospital covered the flow cytometry expenses as part of routine diagnostic testing. The sponsors were not involved in the study conceptualization; data collection, or analysis; manuscript preparation, or making the decision to submit it for publication.

Disclosure of interests: The authors have no financial or other relationships that could affect the objectivity of the presented results and their interpretation.

Statement of originality: The authors declare that the submitted manuscript is their original work. The authors collected and analyzed all data presented in the article specifically for this study. No previously obtained or published material (text, images, or data) was used in this work.

Data availability statement: The editorial policy regarding data sharing does not apply to this work.

Generative AI: No generative artificial intelligence technologies were used to prepare this article.

Provenance and peer-review: This paper was submitted unsolicited and reviewed following the standard procedure. The peer-review process involved two members of the Editorial Board.

About the authors

Luidmila A. Anisko

City Clinical Hospital of Infectious Diseases; Belarusian State Medical University

Author for correspondence.
Email: lanisko@internet.ru
ORCID iD: 0000-0002-5466-2590
SPIN-code: 8389-1870

MD, Cand. Sci. (Medicine), Assistant Professor

Belarus, 76 Kropotkina st, Minsk, 220002; Minsk

Igor A. Karpov

Belarusian State Medical University

Email: vip.kia1957@gmail.com
ORCID iD: 0009-0004-5432-2133
SPIN-code: 6594-8929

MD, Dr. Sci. (Medicine), Professor

Belarus, Minsk

References

Supplementary files