MODELING OF VIBRIO CHOLERA BIOFILMS IN VITRO AND IN VIVO, A LITERATURE REVIEW



Cite item

Full Text

Open Access Open Access
Restricted Access Access granted
Restricted Access Subscription or Fee Access

Abstract

BACKGROUND This review summarizes current understanding of Vibrio cholerae biofilm formation, in vitro modeling methods on abiotic and biotic substrates, including field studies, biofilm detection methods, and the use of in vivo methods to understand and assess the infectivity of biofilm cultures. Particular attention is paid to the role of molecular genetic methods in studying biofilm formation in V. cholerae. Summarizing existing information is important because there are currently no standardized methods for recording biofilm formation and quantifying its constituent microorganisms. The review concludes that an integrated approach to studying biofilm formation, including microbiological, microscopic, and molecular genetic methods, is the most effective. Problems and promising research areas in this area are also discussed. Scopus, Web of Science, MedLine, Russian Science Citation Index (RSCI), and other databases were used for this literature review.

Conclusion A number of current issues are analyzed and prospects for research on V. cholerae biofilms, including the latest molecular genetic methods, are presented. Research on biofilms formed by vibrios, using a range of methods, will allow for a deeper understanding of the general principles of bacterial coexistence in communities and prepare for the fight against cholera.

Full Text

Обоснование

Упоминание о заболевание, напоминающем холеру, встречаются с древних времен до нашей эры. На основании результатов полевых исследований, проведенных в водоёмах в Индии и Бангладеш, было отмечено, что после удаления из воды крупных частиц (>20 мкм) простым фильтрованием через мельничную ткань заболеваемость холерой снижалась [1]. Расшифровка этого феномена показала, что его причиной явилось нахождение возбудителя холеры в составе биоплёнок, покрывавших отфильтрованные частицы. Это наблюдение явилось прямым доказательством роли биоплёнок в эпидемиологии холеры и способствовало активному изучению биоплёночных форм. Первые опыты в отношении формирования биоплёнок V. cholerae представили Watnick P.I., Kolter R. (1999 г.) на модели стандартного 96-луночного планшета с дальнейшим окрашиванием кристаллвиолетом (CV) [2, 3, 4]. По интенсивности связавшегося красителя адгезированными бактериями, оценивали биомассу сформированной биоплёнки спектрофотометрически. Этот метод прост, даёт суммарную оценку биоплёночного роста, однако не различает живые и мёртвые клетки и c некоторыми изменениями встречается в работах ряда авторов [5, 6, 7, 8, 9, 10]. В течение последних 25 лет предложено много моделей биоплёнкообраования, но на сегодняшний день нет унифицированных методов, регистрирующих образование биоплёнки и количественное определение составляющих её микроорганизмов.

Методы исследования биоплёнок.

In vitro модели. Изучение архитектуры биоплёнок невозможно без микроскопических методов, поэтому исследователи использовали в качестве подложки для формирования биоплёнок полистироловые и стеклянные поверхности, включая покровные стекла. С помощью световой микроскопии зарегистрирована адгезия холерных вибрионов к полистироловым лункам или к поверхности боросиликатного предметного стекла с вогнутой лункой, заполненной бульоном LB [2]. Для конфокальной сканирующей лазерной микроскопии использовали флуоресцентные красители или штаммы V. cholerae, в которых трансформирована плазмида pSMC2, ген зелёного флуоресцентного белка GFP. В результате получено трёхмерное изображение структуры биоплёнки, визуализированы особенности морфологии, в частности «столбы» клеток и каналы, образование многослойных кластеров. Giacomucci S. с соавт. (2019 г.) наблюдали увеличение количества безжгутиковых V. сholerae при добавлении полимиксина В (PmB) – катионного антибактериального пептида, что приводило к снижению подвижности и способности к образованию биоплёнки, в то же время экспрессия флагеллина не снижалась в присутствии субингибирующей концентрации PmB [11]. Wucher B.R. с соавт. (2019 г.) обнаружили нитевидные клетки филаментирующего штамма V. сholerae О139, продуцирующего биоплёнки, которые не зависели от первичных секретируемых компонентов матрицы биоплёнки и имели архитектурную прочность и большое конкурентное преимущество в колонизации и распространении на частицах хитина [12]. С помощью сканирующей электронной микроскопии выявлены особенности цитоархитектоники в зависимости от стадии формирования биоплёнки [6]. По мнению авторов, признаками формирования биоплёнки явились полиморфизм морфологии клеток в виде типичных клеток по периферии, наличие кокковидных и полых клеток, тяжей; розоватый или зеленоватый цвет субстанции между клетками – экзополисахаридный матрикс. Для динамичного наблюдения от стадии адгезии до зрелой биоплёнки Титовой С.В. с соавт. (2022 г.) разработан метод биоплёнкообразования холерными вибрионами с использованием световой и люминесцентной микроскопии и одномоментной оценкой жизнеспособности холерных вибрионов [13].

Определенную роль в изучении процесса биоплёнкообразования и ультраструктуры биоплёнок сыграло применение методов трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ). С помощью различных вариантов контрастирования Головиным С.Н. с соавт. (2017) по определённым морфологическим признакам установлена роль составляющих структур биоплёнки холерных вибрионов, включая форму тела клетки и отсутствие/наличие жгутика, а также структуру матрикса [14].

Оценка способности штаммов V. cholerae выживать в окружающей среде сохраняет свою актуальность на протяжении всего времени изучения возбудителя. Экспериментальные условия, приближенные к естественным, способствуют внедрению в практику динамичных (проточных) моделей. Немногочисленные исследования в этом направлении позволили M.C. Miller с соавт. (2007 г.) заключить, что мутанты V. cholerae по синтезу экзополисахарида вибрионов (VPS) – основного компонента матрикса клетки или по Quorum Sensing (QS)-системе, обеспечивающей кооперативное поведение вибрионов, не способны образовывать биоплёнки в статических условиях, но способны формировать их в проточных условиях [15]. Это указывает на существование альтернативных путей адгезии и матриксообразования, проявляющихся при постоянном притоке питательных веществ и удалении метаболитов.

Для экспериментального моделирования моно- или смешанных биоплёнок V. cholerae используют различные абиотические субстраты, встречающиеся в поверхностных водоёмах (фрагменты пластика, в том числе медицинских масок) и биотические (хитиновые фрагменты панцирей ракообразных, микроводоросли, простейшие). Известно также и о влиянии разных температурных условий на процесс образования биоплёнок [13, 16]. На всех абиотических и биотических субстратах холерные вибрионы способны к сохранению в биоплёночных формах при температурах, соответствующих всем климатическим сезонам [16, 17, 18]. Kesy K. с соавторами (2021 г.) исследовали динамику колонизации холерными вибрионами микропластика, используя гранулы полиэтилена и полистирола in vitro и во внешней среде [19]. Michael J. Ormsby с соавторами (2024 г.), используя экспериментальную установку, обеспечивали контакт имитантов паводковых и сточных вод, содержащих токсигенные V. cholerae с пластиковыми и органическими отходами (листья, кожура бананов) [20]. Колонизацию пластика и органических субстратов представителями рода Vibrio после подращивания в питательных средах, в том числе селективных (TCBS) детектировали в ПЦР по наличию специфичных генов (ompW, epsM, ctxA, tcpA, rfbO1, rfbO139) и 16S рРНК. По мнению авторов, вибрионы являются ранними колонизаторами пластика в окружающей среде, которая может выступать в качестве резервуара, а последующий перенос образцов в паводковые воды продемонстрировал потенциал для широкого распространения холеры [20].

  1. cholerae способны образовывать смешанные биоплёнки на хитиновых субстратах в толще воды и при совместном культивировании с простейшими. Rahman M.H., с соавт. (2022 г.) предположили возможность образования смешанных бактериальных популяций в пищеварительной вакуоле простейших, где окислительные радикалы вызывают SOS-реакцию V. cholerae, повышая экспрессию интегрон-интегразы и усиливая интеграцию перенесённых генных кассет. При этом V. cholerae использует систему секреции VI типа (T6SS) для поглощения ДНК других бактерий в пищевой вакуоле простейших. Это исследование показывает, что пищеварительные вакуоли простейших могут быть важной нишей, в которой холерный вибрион способствует созданию генетического разнообразия посредством SOS-индуцированной горизонтальной передачи генов [21].

Недавно было показано, что холерный вибрион может формировать полибиоплёнки с некоторыми представителями кишечной микрофлоры. В частности, комменсальная бактерия Paracoccus aminovorans, выделенная из кишечника людей в эндемичных по холере районах, вступает во взаимодействие с вибрионом: эти два вида вместе образуют устойчивую смешанную биоплёнку на границе воздуха и жидкости, а присутствие P. aminovorans в кишечнике мышей значительно усиливает колонизацию V. cholerae [22]. Важным условием этого эффекта является синтез вибрионом матрикса, состоящего из экзополисахарида и матриксных белков, то есть комменсал стимулирует V. cholerae формировать биоплёнку в кишечнике, что приводит к повышению вирулентности. Эти данные свидетельствуют о перспективности изучения биоплёнок V. cholerae как части полимикробных сообществ, в которых иные микроорганизмы могут либо способствовать, либо препятствовать образованию смешанных биоплёнок.

In vivo модели. Чтобы оценить роль биоплёнки при попадании её в организм хозяина (in vivo) используют модель новорожденных мышат, в кишечнике которых V. cholerae может размножаться и вызывать клинически похожий на холеру процесс. Показано, что при заражении мышей вибрионами, предварительно сформировавшими биоплёнку, колонизация кишечника проходит значительно эффективнее, чем при заражении планктонными клетками [23]. Биоплёночный рост в организме может происходить на пищевых частицах или в составе муциновых комков в просвете кишечника, где вибрионы временно задерживаются в агрегированном состоянии. Кроме того, биоплёнка может формироваться на поверхности хитиновых структур, попавших в желудочно-кишечный тракт (например, в виде фрагментов планктона с фиксированными на них вибрионами). Для имитации таких ситуаций в экспериментах используют модель заражения взрослых кроликов: в петлю тонкого кишечника вводят взвесь V. cholerae как в виде отдельных клеток, так и в составе биоплёнок (полученных in vitro). Показано, что агрегированные вибрионы вызывают более быстрый и тяжёлый токсино-индуцированную диарею у кроликов, то есть обладают повышенной инфекциозностью, соответствуя явлению гиперинфективности [24]. Эти наблюдения in vivo подтверждают, что биоплёнка играет критическую роль на ранних этапах инфекции, увеличивая шансы возбудителя на успешное развитие инфекции в новом хозяине.

Учитывая экологические резервуары возбудителя, исследователей привлекла рыба иллиший (Tenualosa ilisha) – распространённый в Бангладеш промысловый вид, который употребляется в пищу без достаточной термообработки. Выяснилось, что до трети молодых особей иллишия несут в кишечнике V. cholerae (как правило, nonO1/nonO139 серогрупп). Кроме того, в образцах кишечного содержимого рыб с помощью ПЦР-анализа обнаруживали гены матриксных компонентов (vpsA, vpsL, vpsR), что позволяет допустить возможность нахождения вибрионов в форме биоплёнок [25]. На основании этих данных можно предположить, что рыбы могут служить “инкубатором” биоплёночных форм вибриона, способствуя его выживанию и попаданию в организм человека. Adade N.E., с соавт. (2025 г.) токсигенность холерных вибрионов проверяли на модели Galleria mellonella, вводя личинкам пробу объемом 10 мкл непосредственно в гемоцель через последнюю правую заднюю лапку (ложноножку). Выживаемость оценивали в течение 72 часов, личинки считались мёртвыми, если не реагировали на прикосновение [10]. Из вышеизложенного следует, что именно сочетание методов in vitro и in vivo способствует более глубокому изучению всех этапов формирования биоплёнки V. choleraе и её значимости в процессе инфицирования макроорганизма. 

Методы анализа биоплёнок

Для количественной оценки образования биоплёнок V. cholerae применяют как прямые, так и косвенные подходы. Прямые методы направлены на непосредственное измерение количества клеток в биоплёнке. К ним относится подсчёт жизнеспособных клеток после разрушения биоплёнки ресуспендированием и диспергированием путём обработки в ультразвуковой водяной бане, [26], а также удалением с поверхности субстрата клеток с последующим высевом [6] или методом отпечатков на пластины питательного агара и тогда по числу образовавшихся колоний (КОЕ) судят о размерах популяции в биоплёнке [13, 16]. Эти методы трудоёмки и не учитывают некультивируемую долю бактерий, но отличаются простотой и не требуют сложного оборудования.

В число косвенных методов входят: окраска кристаллвиолетом структур биоплёнок с последующей их отмывкой и определением оптической плотности матрикса биоплёнки на поверхности субстратов, коррелирующей с биомассой биоплёнки – простой и воспроизводимый способ оценки общего количества прикреплённых клеток и матрикса. При интерпретации косвенных методов учитывают и живые и мёртвые клетки, что не отражает истинное число бактерий. Поэтому комбинируют несколько подходов: например, проводят окраску кристаллвиолетом для общей биомассы и подсчет живых клеток по числу КОЕ.

Для оценки биоплёнкообразования предложено несколько количественных показателей. Индекс образования бактериальной биоплёнки (BFI), учитывает следующие факторы: динамику BFI (отсутствие образования, непрерывное увеличение и увеличение с последующим уменьшением), время (раннее: 24 часа; позднее: от 48 до 72 часов) и степень BFI (отсутствие, слабая, умеренная и сильная). Каждому фактору было присвоено числовое значение, чтобы соотнести полученный профиль BFI с уровнем риска [27]. Меньшикова Е.А. с соавторами (2021) предложили рассчитывать показатель биоплёнокобразования (ПБ) по отношению количества клеток V. cholerae на фрагменте хитинового панциря к количеству их в планктоне. На основании этого метода авторам удалось установить различную скорость образования биоплёнок у токсигенных штаммов водного и клинического происхождения. Этими же авторами для оценки способности холерных вибрионов десорбироваться из биоплёнки в окружающую среду введён показатель – индекс десорбции (ИД), который рассчитывали, как отношение количества микробных клеток в планктоне к количеству их в биоплёнке. Способность холерных вибрионов преодолевать антагонизм со стороны конкурирующего штамма при формировании сложной биоплёнки упомянутыми выше авторами был введен показатель – «коэффициент ингибиции» (КИ), который рассчитывали, как отношение числа клеток вибрионов в присутствии гетерологичного штамма к числу клеток в условиях монокультуры [16].

Для детекции биоплёнок V. cholerae в объектах окружающей среды или в клинических образцах применяют методы микроскопии. Прямое микроскопическое исследование с применением флуоресцентной маркировки позволяет визуализировать наличие биоплёночных структур. Например, при эпифлуоресцентной микроскопии воды, после её концентрирования фильтрацией, можно обнаружить скопления вибрионов, окрашенных ДНК-специфичным красителем, что указывает на наличие микроагрегатов (биоплёнки) в пробе. Электронная микроскопия (например, сканирующая) даёт возможность рассмотреть архитектуру зрелой биоплёнки на поверхности – клетки, погружённые в матрикс, поры и каналы. Однако такие исследования требуют сложного оборудования и подготовки образцов.

Использование молекулярно-генетических методов в исследовании биоплёнок

Выявление специфических генов, ассоциированных с биоплёнкой, с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), широко применяется для детекции и анализа микроорганизмов, формирующих биоплёнки. Многочисленные работы показали участие в этом процессе генов, детерминирующих продукцию маннозочувствительных гемагглютинирующих пилей адгезии (MSHA) [2, 28, 29, 30, 31], биосинтеза внеклеточного матрикса, в частности кластеров VPS I и VPS II, и rbmA-F [32, 33, 34, 35, 36, 37], и белка внеклеточного матрикса Bap1 [38, 39, 40, 41]. Для диких штаммов, стабильно формирующих биоплёнки, характерно наличие основных генов вирулентности: ctxA, ctxB, zot, ace, tcpA, hlyA, rtxA, ompU, toxR, T6SS, alsD, makA, островов патогенности: VPI-1, VPI-2, VSP-1 и VSP-2 [25, 42].

Метод ПЦР в реальном времени с обратной транскипцией (ОТ-ПЦР) позволяет количественно оценить экспрессию генов матрикса (кластер VPS) или регуляторов (например, vpsR), при этом высокая экспрессия этих генов указывает на значительную долю клеток, находящихся в биоплёночном состоянии. У большинства изолятов были обнаружены низкие пороговые циклы (Ct<20) по генам vpsA и vpsL, что свидетельствовало об их присутствии у всех испытуемых  штаммов [25]. Сравнительная оценка количества клеток V. cholerae, полученных двумя методами бактериологическим и ПЦР–РВ, показала их воспроизводимость и сопоставимость [13, 18].

Изотермическая амплификация (LAMP) также рассматривается как перспективный подход для быстрой полевой диагностики биоплёнкообразующих патогенов, включая Vibrio spp., без необходимости термоциклирования [43]. В частности, разработаны мультиплексные ПЦР-наборы для одновременной идентификации нескольких видов Vibrio в том числе по их генам вирулентности (например, ген ctxA токсина холеры) за один прогон, что ускоряет мониторинг возбудителя в природных биоплёнках [25].

Для дифференциации биоплёночных и планктонных клеток применяют и инновационные методы РНК-визуализации. Одно-молекулярная FISH (флуоресцентная гибридизация для детекции РНК in situ) с зондами к матрикс-специфичным мРНК использована для количественного определения экспрессии генов в отдельных клетках, в том числе, внутри биоплёнки [44]. Этот подход позволил непосредственно наблюдать гетерогенность генетической активности: в разных зонах биоплёнки V. cholerae экспрессия генов матрикса и вирулентности варьировала, образуя функционально разные субпопуляции клеток. Таким образом, современные молекулярные методы расширяют наши возможности по обнаружению и характеристике биоплёнок, дополняя классические микробиологические и микроскопические подходы.

Полное геномное секвенирование микроорганизмов (WGS) и последующий биоинформатический анализ существенно углубили наше понимание генетических основ биоплёнкообразования. Анализ полного транскриптома (общего профиля РНК) в последние годы стал основным инструментом для изучения изменений транскриптома при формировании биоплёнки по сравнению с планктонной формой [45]. Сравнение геномов V. cholerae выявило у большинства эпидемических изолятов присутствие двух консервативных кластеров генов биоплёнки (VPS-I иVPS-II), однако ряд нетоксигенных природных штаммов может утрачивать эти кластеры либо иметь мутации в ключевых регуляторах (например, во вторичных мессенджерных системах), что отражается на способности биоплёнкобразования [46]. Транскриптомный подход помог выявить ряд ключевых регуляторных сдвигов: известно, что при переходе к биоплёнке у V. cholerae существенно повышается экспрессия генов матрикса (опероны vps, гены rbmA, rbmC, bap1 и др.), а также генов факторов колонизации и вирулентности (например, токсин-корегулируемый пилин TCP и регулятор ToxT) [23]. Так, Gallego-Hernandez и соавт. (2020) провели сравнение экспрессии генов у V. cholerae в биоплёночном и планктонном состоянии, обнаружив, что в биоплёнке усиливается транскрипция ряда генов вирулентности (включая регулятор токсина toxT). Это объясняет феномен гиперинфекционности биоплёночных вибрионов: находясь в биоплёнке, бактерии заранее активируют факторы патогенности, что повышает эффективность последующей колонизации тонкой кишки [23]. Данный вывод, сделанный на основе RNA-seq, имеет важное прикладное значение для понимания эпидемиологии холеры.

В большинстве работ отмечается высокая корреляция результатов RNA-seq и ОТ-PCR [45]. Тем не менее, транскриптомный подход имеет ограничения: он отражает лишь средние уровни РНК в массиве образца клеток, тогда как в пределах биоплёнки могут существовать микрониши с разным фенотипом.

Транспозонный мутантный анализ (Tn-seq), применяется для поиска генов, необходимых для роста бактерий в составе биоплёнки. Создаётся большая библиотека случайных вставок транспозона по всему геному, после чего популяцию выращивают при разных условиях (в биоплёнке и в суспензии). Посредством секвенирования (WGS) определяют локализацию каждой мутации [45]. Такой подход позволил выявить десятки генов, обеспечивающих конкурентоспособность V. cholerae в биоплёнке, включая гены типа VI секреторной системы, метаболизма и репарации ДНК [47, 48, 49]. В перспективе Tn-seq и анализ данных транскриптома позволят выявлять гены, участвующие в формировании биоплёнки или ингибирующиеся при её образовании [50].

Представлено использование ОТ-PCR для изучения фактора транскрипции vpsR и малых регуляторных РНК [51]. Показано, что мутация по гену fur (репрессор усвоения железа) усиливает образование биоплёнки у V. cholerae, при этом с помощью qPCR подтверждено повышение транскрипции целевых генов биоплёнки (vpsU, vpsA-K) по сравнению с диким типом.

Роль генов в формировании биоплёнок V. cholerae

   Методы направленного мутагенеза и генно-инженерные подходы традиционно применяют для выявления функций предполагаемых регуляторов. Одним из первых достижений было открытие мутации в гене hapR (кодирующем регулятор QS-системы): показано, что штаммы V. cholerae с инактивирующими мутациями hapR образуют выраженные биоплёнки (шероховатые колонии) и обладают повышенной кислотоустойчивостью, и тем самым повышают способность к колонизации стенок кишечника [52]. Напротив, гиперактивность HapR подавляет образование биоплёнки. К настоящему времени насчитывается более 30 т.п.н. в генах vps, мутации в любом гене vps кластера и генах: rbmA, rbmCи bap1 снижают способность холерных вибрионов формировать биоплёнку [36, 53, 54]. Экспрессия БП опосредуется системой QS через активность сигнальных молекул – аутоиндукторов AI-2 и CAI-1, и транскрипционных активаторов [55], при этом регуляторный каскад приводит к изменению транскрипции белка AphA, малых РНК VqmA и VqmR. Рецептор VqmA улавливает небольшую молекулу DPO (3,5-диметилпирозин-2-ол) и в ответ репрессирует регулятор AphA, что ведет к подавлению образования биоплёнки независимо от основного каскада QS [56]. Авторы считают, что структурно-функциональный анализ механизмов регуляции транскрипции VqmA у Vibrio spp. может быть информативен для разработки лекарств, предназначенных для борьбы с инфекциями.

Не менее важна функция вторичного мессенджера С-di-GMP, который необходим клеткам холерных вибрионов, в том числе и для образования биоплёнки [57]. Экспериментально доказано, что мутации, повышающие уровень c-di-GMP, приводят к гипербиоплёночному фенотипу, ингибируют продукцию и сборку жгутика холерного вибриона, снижают подвижность бактерий, подавляют экспрессию гена вирулентности [58, 59], создают комплекс с белком VpsR-продуктом регуляторного гена [57, 59]. Установлена связь между уровнем продукции ц-ди-ГМФ и образованием биоплёнок [60].

Описана роль индола в процессе формирования БП, которая возможно опосредована через изменение активности ToxR и ToxR-зависимого регулятора LeuO.  Экспрессия leuO увеличивалась под воздействием экзогенного индола, что приводило к подавлению регуляции вирулентности ToxR и способствовало увеличению биоплёнкообразования [61]. Имеются сообщения о роли белков флагеллина в биоплёнкообразовании [62], при этом подавление формирования жгутиков усиливало образование vps-независимой биоплёнки [63]. Авторы с помощью хемитаксического анализа продемонстрировали, что vps-независимой биоплёнки в отличие от vps-зависимой биоплёнки способствовала бактериальному движению к хитину и источнику фосфата в фильтрованной стерилизованной озерной воде. Авторы полагают, что в пресноводных водоёмах, подавление у V. cholerae продукции жгутиков, усиливает vps-независимую биоплёнку, которая помогает бактериям получать питательные вещества, включая фосфат и повышает способность сохраняться в условиях ограниченных питательных веществ.

Протеомный анализ показал, что потеря белка BipA приводит к изменению синтеза более 300 белков у Vibrio cholerae при температуре 22 °C, увеличивая выработку белков, связанных с биоплёнкой, в том числе ключевых активаторов транскрипции VpsR и VpsT, а также белков, важных для различных клеточных процессов [64].

Важной проблемой остается результат воздействия факторов стресса на процесс образования БП. Эксперименты показали существенное изменение фенотипа, появление новых SNP в ответ на факторы стресса, а также отмечено изменение морфологии колоний и повышенное образование биоплёнки [10].

Стоит отметить метагеномный подход — секвенирование суммарного пула ДНК непосредственно из биоплёнки, без выделения отдельных культур, что позволяет определить видовой пейзаж многовидовой биоплёнки [65]. Анализ водных сообществ показывает, что V. cholerae часто сосуществует с другими бактериями в биоплёнках на поверхности планктона, и такие сообщества могут влиять на его выживание и горизонтальный перенос генов [66]. Метагеномика и метатранскриптомика (анализ РНК сообщества) позволят исследовать биоплёнки непосредственно, не прибегая к культивированию бактерий.

Проблемы и перспективы развития исследований

Несмотря на существенный прогресс, сохраняется ряд вызовов в проблеме изучения бактериальных биоплёнок. Во-первых, отсутствие стандартизированных протоколов для диагностики биоплёнок в клинической практике остаётся проблемой [67]. Ни один из методов (окраска образцов, ПЦР, секвенирование) пока не стал "золотым стандартом" для выявления биоплёнки непосредственно in vivo. Биоплёнки в организме часто трудно обнаружить из-за малого размера очагов и отсутствия биомаркеров, констатирующих присутствие биоплёнки. Комбинация методов визуализации (эндоскопия, микроскопия) и молекулярных методов требует времени и подготовки образцов, что затрудняет быстроту получения результатов. Перспективным решением видится разработка реагентов или зондов (например, меток, связывающихся с полисахаридом матрикса), пригодных для неинвазивной визуализации биоплёнок in vivo. Кроме того, использование масс-спектрометрии (MALDI-TOF) рассматривают как быстрый метод идентификации штаммов, формирующих биоплёнку и даже дифференциации биоплёночных и планктонных форм по белковым профилям. Однако пока MALDI-TOF не оправдал ожиданий ввиду сложности [67] пробоподготовки и интерпретации спектров биоплёнки.

Во-вторых, анализ гетерогенности биоплёнки остаётся трудно разрешимой задачей. Классические методы (включая стандартный RNA-seq и WGS) работают с усреднённой пробой, тогда как внутри биоплёнки клетки различаются по активности и функциям. Биоплёнка построена неравномерно: клетки на периферии и внутри значительно отличаются по доступности питательных веществ, кислорода и экспрессии генов. Внутри биоплёнки могут формироваться субпопуляции персисторов – клеток с пониженным метаболизмом, крайне устойчивых к антибиотикам и другим стрессорам. У V. cholerae персисторные клетки в биоплёнке могут способствовать сохранению очага инфекции при неблагоприятных условиях (например, под действием температуры, желчи или кишечных антимикробных пептидов). Эту проблему могут решить методы анализа единичных клеток, но они требуют специальных разработок для широкого применения. Будущие исследования, вероятно, сфокусируются на сочетании, например, флюоресцентной гибридизации in situ с последующим секвенированием микропрепарата. Подобные технологии (пространственный транскриптомный анализ) уже применяются в исследовании тканевых срезов в медицине, и их адаптация к микробным биоплёнкам – вопрос времени.

В-третьих, не решена проблема интерпретации получаемых данных. Применение одновременно методов геномики, транскриптомики, протеомики и метаболомики при анализе отдельной биоплёнки генерирует огромные массивы информации. Объединение этих данных для построения целостной модели биоплёнки требует разработки как новых биоинформатических подходов, так и междисциплинарного сотрудничества [49]. Особенно сложно соотнести между собой, например, анализ уровня мРНК и продукции соответствующего белка, учитывая возможность посттранскрипционной регуляции. Тем не менее, такие интегративные исследования крайне перспективны: они позволят выявить узловые точки (“ахиллесовы пяты”) формирования биоплёнки, воздействие на которые (например, ингибитором фермента или антителом к матриксному белку) сможет разрушить биоплёнку или сделать её уязвимой.

В контексте холерного вибриона остаются актуальными вопросы о том, каким образом факторы окружающей среды влияют на образование биоплёнки, которое способствует адаптации и персистенции V. cholerae в объектах окружающей среды. Известно, что физические показатели воды (температура, солёность, наличие фитопланктона) воздействуют на регуляторные сети V. cholerae, вызывая перестройку метаболизма клетки [35]. Есть некоторые свидетельства того, что образование биоплёнок имеет решающее значение для колонизации кишечника [35], и было высказано предположение о повышенной инфекционности V. cholerae в форме биоплёнки [26]. Решение этой проблемы требует сочетания мониторинга in situ (метагеномика) с экспериментами по анализу экспрессии генов. Ещё один нерешённый вопрос – состояние некультивируемых культур (НС) у V. cholerae. Известно, что вибрионы способны переходить в НС состояние и утрачивать способность к росту на питательных средах, часто это связано с нахождением в биоплёнках в неблагоприятных условиях. Выявление некультивируемых форм возможно только молекулярными методами (ПЦР, метаболическая РНК-маркировка), и дальнейшее усовершенствование этих методов позволит точнее оценить эпидемиологический риск от "дремлющих" вибрионов в окружающей среде [21].

Заключение. Биоплёнки V. cholerae – сложное и многогранное явление на стыке экологии и патогенеза. Новейшие молекулярно-генетические методы дают возможность идентифицировать способность вибрионов к адаптации и успешному существованию в водной среде и кишечнике человека и соответственно разрабатывать профилактические мероприятия.  Тем не менее, ряд вопросов остаётся открытым – от совершенствования диагностики биоплёнок in vivo до разработки универсальных способов их элиминации.

×

References

  1. Colwell R.R., Huq A., Islam M.S., Aziz K.M., Yunus M., Khan N.H., et al. Reduction of cholera in Bangladeshi villages by simple filtration. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 Feb 4;100(3):1051–5. doi: 10.1073/pnas.0237386100.
  2. Watnick P.I., Kolter R. Steps in the development of a Vibrio cholerae El Tor biofilm. Mol Microbiol. 1999;34(3):586–95. doi: 10.1046/j.1365-2958.1999.01624.x.
  3. Costerton J.W., Stewart P.S., Greenberg E.P. Bacterial Biofilms: A Common Cause of Persistent Infections. Science. 1999; 284: 1318–1322. doi: 10.1126/science.284.5418.1318.
  4. O'Toole G.A., Kolter R. Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signalling pathways: a genetic analysis. Mol Microbiol.1998; 28 (3):449–461. doi: 10.1046/j.1365-2958.1998.00797.x.
  5. Tatarenko O.A., Alekseeva L.P., Telesmanich N.R., Shestialtynova I.S., Chemisova O.S., Markina O.V. et al. The effect of certain factors on the formation of biofilms by toxigenic and atoxigenic El Tor Vibrio cholerae. Epidemiology and Infectious Diseases.2012; 5: 36–40. (in Russian)
  6. Kulikalova E.S., Urbanovich L.Ja., Sappo S.G., Mironova L.V., Markov E.Ju., Mal'nik V.V. et al. Cholera Vibrio biofilm: production, characteristics, and role in the reservoir of the pathogen in the aquatic environment. Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology. 2015;1:3–11. (in Russian)
  7. Sizova Ju.V., Cherepahina I.Ja., Burlakova O.S. The role of surface water temperature in the persistence and biofilm formation of Vibrio cholerae of various epidemic significance. Modern Problems of Science and Education. 2015; 5: 690. (in Russian)
  8. Waseem M., Williams J.Q.L., Thangavel A., Still P.C., Ymele-Leki P. A structural analog of ralfuranones and flavipesins promotes biofilm formation by Vibrio cholerae. PLoS One. 2019;14(4):e0215273. doi: 10.1371/journal.pone.0215273.
  9. Bahroudi M., Bakhshi B., Soudi S., Najar-Peerayeh S. Antibacterial and antibiofilm activity of bone marrow-derived human mesenchymal stem cells secretome against Vibrio cholerae. Microb Pathog. 2019;139:103867. doi: 10.1016/j.micpath.2019.103867.
  10. Adade N.E, Ahator S.D., García-Romero I., Algarañás M., Appiah V., Valvano M.A., Duodu S. Stress adaptation under in vitro evolution influences survival and metabolic phenotypes of clinical and environmental strains of Vibrio cholerae El-Tor. Microbiol Spectr. 2025;13(3):e0121124. doi: 10.1128/spectrum.01211-24.
  11. Giacomucci S., Cros C.D., Perron X., Mathieu-Denoncourt A., Duperthuy M. Flagella-dependent inhibition of biofilm formation by sub-inhibitory concentration of polymyxin B in Vibrio cholerae. PLoS One. 2019; 14(8):e0221431. doi: 10.1371/journal.pone.0221431.
  12. Wucher B.R., Bartlett T.M., Hoyos M., Papenfort K., Persat A., Nadell C.D. Vibrio cholerae filamentation promotes chitin surface attachment at the expense of competition in biofilms. Proc Natl Acad Sci U S A. 2019;116(28):14216–14221. doi: 10.1073/pnas.1819016116.
  13. Titova S.V., Men'shikova E.A., Vodop'janov S.O., Olejnikov I.P., Borodina T.N. Study of the biofilm form of Vibrio cholerae by PCR-RV. Epidemiology and Infectious Diseases. 2022; 27(1): 23–32. doi: 10.17816/EID109894. (in Russian)
  14. Golovin S.N., Simonova I.R., Titova S.V., Verkina L.M., Bereznjak E.A., Trishina A.V. Study of Vibrio cholerae biofilms using transmission electron microscopy. Clin. Lab. Diagnostics. 2017; 62 (9): 568–576. doi: 10.18821/0869-2084-2017-62-9-568-576. (in Russian)
  15. Miller M.C., Keymer D.P., Avelar A., Boehm A.B., Schoolnik G.K. Detection and transformation of genome segments that differ within a coastal population of Vibrio cholerae strains. Appl. Environ. Microbiol. 2007; 73 (11): 3695–3704. doi: 10.1128/AEM.02735-06.
  16. Men'shikova E. A., Kurbatova E. M., Vodop'janov S. O., Pisanov R. V., Titova S. V. Evaluation of the ability of Vibrio cholerae to form a biofilm on the surface of a river crab's chitinous shell. Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology. 2021; 98: 434–439.doi.org/10.36233/0372-9311-99. (in Russian)
  17. Vodop'janov S.O., Titova S.V., Vodop'janov A.S., Verkina L.M., Olejnikov I.P., Pisanov R.V. et al. Study of interspecies competition of Vibrio cholerae in biofilms. Public Health and Life Environmen. 2017; 3 (288): 51-54. doi: 10.35627/2219-5238/2017-288-3-51-54. (in Russian)
  18. Poleeva M.V., Chemisova O.S., Vodopyanov S.O., Menshikova E.A., Kurbatova E.M. Experimental study of the formation of biofilms by Vibrio parahaemolyticus on the surfaces of biotic objects. Bulletin of Perm University. Series: Biology.2019; 4: 417–425. (in Russian)
  19. Kesy K., Labrenz M., Scales B.S., Kreikemeyer B., Oberbeckmann S. Vibrio Colonization Is Highly Dynamic in Early Microplastic-Associated Biofilms as Well as on Field-Collected Microplastics. Microorganisms. 2021; 9 (76). doi.org/10.3390/ microorganisms9010076.
  20. Ormsby M.J., Woodford L., White H.L., Fellows R., Oliver D.M., Quilliam R.S. Toxigenic Vibrio cholerae can cycle between environmental plastic waste and floodwater: Implications for environmental management of cholera. J Hazard Mater. 2024;461:132492. doi: 10.1016/j.jhazmat.2023.132492.
  21. Rahman M.H., Mahbub K.R., Espinoza-Vergara G., Ritchie A., Hoque M.M., Noorian P., et al. Protozoal food vacuoles enhance transformation in Vibrio cholerae through SOS-regulated DNA integration. Md ISME J. 2022;16(8):1993–2001. doi: 10.1038/s41396-022-01249-0.
  22. Barrasso K., Chac D., Debela M.D., Geigel C., Steenhaut A., Rivera Seda A., et al. Impact of a human gut microbe on Vibrio cholerae host colonization through biofilm enhancement. Elife. 2022;11:e73010. doi: 10.7554/eLife.73010.
  23. Gallego-Hernandez A.L., DePas W.H., Park J.H., Teschler J.K., Hartmann R., Jeckel H., et al. Upregulation of virulence genes promotes Vibrio cholerae biofilm hyperinfectivity. Proc Natl Acad Sci U S A. 2020; 117(20):11010–11017. doi: 10.1073/pnas.1916571117.
  24. Zhu S., Kojima S., Homma M. Structure, gene regulation and environmental response of flagella in Vibrio. Front Microbiol. 2013;4:410. doi: 10.3389/fmicb.2013.00410.
  25. Dey S.S., Hossain Z.Z., Akhter H., Jensen P.K.M., Begum A. Abundance and biofilm formation capability of Vibrio cholerae in aquatic environment with an emphasis on Hilsha fish (Tenualosailisha). Front Microbiol. 2022; 13:933413. doi: 10.3389/fmicb.2022.933413.
  26. Tamayo R., Patimalla B., Camilli A. Growth in a biofilm induces a hyperinfectious phenotype in Vibrio cholerae. Infection and Immunity. 2010;78:3560–3569. doi: 10.1128/IAI.00048-10.
  27. Lucero-Mejía J. E., Romero-Gómez S. de J., Hernández-Iturriaga, M. A new classification criterion for the biofilm formation index: A study of the biofilm dynamics of pathogenic Vibrio species isolated from seafood and food contact surfaces. Journal of Food Science. 2020; 85(8): 2491–2497. doi.org/10.1111/1750-3841.15325.
  28. Alexeyev M.F., Shokolenko I.N. Mini-Tn10 transposon derivatives for insertion mutagenesis and gene delivery into the chromosome of gram-negative bacteria. Gene. 1995;160(1):59–62. doi: 10.1016/0378-1119(95)00141-r.
  29. Marsh J.W., Taylor R.K. Genetic and transcriptional analyses of the Vibrio cholerae mannose-sensitive hemagglutinin type 4 pilus gene locus. J Bacteriol. 1999;181(4):1110–1117. doi: 10.1128/JB.181.4.1110-1117.1999.
  30. Roelofs K.G., Jones C.J., Helman S.R., Shang X., Orr M.W., Goodson J.R., et al. Systematic identification of cyclic-di-GMP binding proteins in Vibrio cholerae reveals a novel class of cyclic-di-GMP-binding ATPases associated with Type II secretion systems. PLoS Pathog. 2015; 11(10):e1005232. doi: 10.1371/journal.ppat.1005232.
  31. Titova S.V., Monahova E.V., Alekseeva L.P., Pisanov R.V. Molecular and genetic basis of biofilm formation as a component of Vibrio cholerae persistence in water bodies of the Russian Federation. Ecological genetics. 2018; 16 (4): 23–32. doi: 10.17816/ecogen16423-32. (in Russian)
  32. Moorthy S., Watnick P.I. Identification of novel stage-specific genetic requirements through whole genome transcription profiling of Vibrio cholerae biofilm development. Molecular microbiology. 2005;57(6):1623–35. doi: 10.1111/j.1365-2958.2005.04797.x.
  33. Fong J.C., Yildiz F.H. The rbmBCDEF gene cluster modulates development of rugose colony morphology and biofilm formation in Vibrio cholerae. Journal of bacteriology. 2007;189(6):2319–30. doi: 10.1128/JB.01569-06
  34. Maestre-Reyna M., Wu W.J., Wang A.H. Structural insights into RbmA, a biofilm scaffolding protein of V. сholerae. PLoS One. 2013; 8 (12):82458. doi: 10.1371/journal.pone.0082458.
  35. Giglio K.M., Fong J.C., Yildiz F.H., Sondermann H. Structural basis for biofilm formation via the Vibrio cholerae matrix protein RbmA. Journal of bacteriology. 2013;195(14):3277–86. doi: 10.1128/JB.00374-13.
  36. Silva A.J., Benitez J.A. Vibrio cholerae Biofilms and Cholera Pathogenesis. PLoSeglrop Dis. 2016;10(2): e0004330. doi: 10.1371/journal.pntd.0004330.
  37. Plehanov N.A., Zadnova S.P. Structural and functional analysis of genes encoding biosynthesis of mannose-sensitive hemagglutinating adhesion pili in various strains of Vibrio cholerae biovar ElTor. Problems of Particularly Dangerous Infections. 2016; 4: 75–78. (in Russian)
  38. Xi D., Yang S., Liu Q., Li Y., Li Y., Yan J., et al. The response regulator ArcA enhances biofilm formation in the vpsT manner under the anaerobic condition in Vibrio cholerae. MicrobPathog. 2020;144:104197. doi: 10.1016/j.micpath.2020.104197.
  39. Absalon C., Van Dellen K., Watnick P.I. A communal bacterial adhesin anchors biofilm and bystander cells to surfaces. PLoS pathogens. 2011;7(8):e1002210. doi: 10.1371/journal.ppat.1002210.
  40. Berk V., Fong J.C., Dempsey G.T., Develioglu O.N., Zhuang X., Liphardt J., et al. Molecular architecture and assembly principles of Vibrio cholerae biofilms. Science. 2012;337(6091):236–9. doi: 10.1126/science.1222981.
  41. Kaus K, Biester A, Chupp E, Lu J, Visudharomn C, Olson R. The 1.9 Å crystal structure of the extracellular matrix protein Bap1 from Vibrio cholerae provides insights into bacterial biofilm adhesion. J Biol Chem. 2019;294(40):14499–14511. doi: 10.1074/jbc.RA119.008335.
  42. Hounmanou Y.M.G., Leekitcharoenphon P., Hendriksen R.S., Dougnon T.V., Mdegela R.H., Olsen J.E., Dalsgaard A. Surveillance and Genomics of Toxigenic Vibrio cholerae O1 From Fish, Phytoplankton and Water in Lake Victoria, Tanzania. Front Microbiol. 2019;10:901. doi: 10.3389/fmicb.2019.00901.
  43. Chen D., Liang Z., Ren S., Alali W., Chen L. Rapid and Visualized Detection of Virulence-Related Genes of Vibrio cholerae in Water and Aquatic Products by Loop-Mediated Isothermal Amplification. J Food Prot. 2022;85(1):44–53. doi: 10.4315/JFP-21-182.
  44. Ogayar E., Larrañaga I., Lomba A., Kaberdin V.R., Arana I., Orruño M. Efficiency and specificity of CARD-FISH probes in detection of marine vibrios. Environ Microbiol Rep. 2021;13(6):928–933. doi: 10.1111/1758-2229.13015.
  45. Almatroudi A. Investigating biofilms: Advanced methods for comprehending microbial behavior and antibiotic resistance. Front Biosci (Landmark Ed). 2024; 29(4):133. doi: 10.31083/j.fbl2904133.
  46. Hsieh M.L., Waters C.M., Hinton D.M. VpsR Directly Activates Transcription of Multiple Biofilm Genes in Vibrio cholerae. J Bacteriol. 2020; 202(18):e00234–20. doi: 10.1128/JB.00234-20.
  47. Townsley L., Sison Mangus M.P., Mehic S., Yildiz F.H. Response of Vibrio cholerae to Low-Temperature Shifts: CspV Regulation of Type VI Secretion, Biofilm Formation, and Association with Zooplankton. Appl Environ Microbiol. 2016;82(14):4441–52. doi: 10.1128/AEM.00807-16.
  48. Fu H., Yu P, Liang W., Kan B., Peng X., Lanming Chen L. Virulence, Resistance, and Genomic Fingerprint Traits of Vibrio cholerae Isolated from 12 Speciesof Aquatic Products in Shanghai, China. Microb Drug Resist. 2020;26(12):1526–1539. doi: 10.1089/mdr.2020.0269.
  49. Dutta A., Valle F., Goldman T., Keating J., Burke E., Williamson N., et al. Translational challenges and opportunities in biofilm science: a BRIEF for the future. NPJ Biofilms Microbiomes. 2022; 8(1):68. doi: 10.1038/s41522-022-00327-7.
  50. Shull L.M., Camilli A. Transposon Sequencing of Vibrio cholerae in the Infant Rabbit Model of Cholera. Methods Mol Biol. 2018;1839:103–116. doi: 10.1007/978-1-4939-8685-9_10.
  51. Gao H., Ma L., Qin Q., Qiu Y., Zhang J., Li J., et al. Fur Represses Vibrio cholerae Biofilm Formation via Direct Regulation of vieSAB, cdgD, vpsU, and vpsA-K Transcription. Front Microbiol. 2020;11:587159. doi: 10.3389/fmicb.2020.587159.
  52. Zhu J., Mekalanos J. J. Quorum sensing-dependent biofilms enhance colonization in Vibrio cholerae. Dev. Cell. 2003; 5: 647–656. doi: 10.1016/S1534- 5807(03)00295-8.
  53. Yildiz F.H., Schoolnik G.K. Vibrio cholerae O1 El Tor: identification of a gene cluster required for the rugose colony type, exopolysaccharide production, chlorine resistance, and biofilm formation. Proc Natl Acad Sci USA. 1999; 96(7):4028–33. doi: 10.1073/pnas.96.7.4028.
  54. Fong J.C., Syed K.A., Klose K.E., Yildiz F.H. Role of Vibrio polysaccharide (vps) genes in VPS production, biofilm formation and Vibrio cholerae pathogenesis. Microbiology. 2010; 156(Pt 9):2757–69. doi: 10.1099/mic.0.040196-0.
  55. Herzog R., Peschek N., Fröhlich K.S., Schumacher K., Papenfort K. Three autoinducer molecules act in concert to control virulence gene expression in Vibrio cholerae. Nucleic Acids Res. 2019;47(6):3171–3183. doi: 10.1093/nar/gky1320.
  56. Wu H., Li M., Guo H., Zhou H., Li B., Xu Q., Xu C., Yu F., He J. Crystal structure of the Vibrio cholerae VqmA-ligand-DNA complex provides insight into ligand-binding mechanisms relevant for drug design. J Biol Chem. 2019;294(8):2580–2592. doi: 10.1074/jbc.RA118.006082.
  57. Conner J.G., Zamorano-Sánchez D, Park JH, Sondermann H, Yildiz FH.The ins and outs of cyclic di-GMP signaling in Vibrio cholerae. Curr Opin Microbiol. 2017;36:20–29. doi: 10.1016/j.mib.2017.01.002.
  58. Tamayo R., Schild S., Pratt J.T., Camilli A. Role of cyclic Di-GMP during el tor biotype Vibrio cholerae infection: characterization of the in vivo-induced cyclic Di-GMP phosphodiesterase CdpA. Infection and immunity. 2008;76(4):1617–27. doi: 10.1128/IAI.01337-07.
  59. Srivastava D., Hsieh M.L., Khataokar A., Neiditch M.B., Waters C.M. Cyclic di-GMP inhibits Vibrio cholerae motility by re- pressing induction of transcription and inducing extracellular poly- saccharide production. Mol. Microbiol. 2013; 90(6):1262–76. doi: 10.1111/mmi.12432.
  60. Huang Q., Zhang M., Zhang Y., Li X., Luo X., Ji S., Lu R. IcmF2 of the type VI secretion system 2 plays a role in biofilm formation of Vibrio parahaemolyticus. Arch Microbiol. 2024;206(7):321. doi: 10.1007/s00203-024-04060-x.
  61. Howard MF, Bina XR, Bina JE. Indole Inhibits ToxR Regulon Expression in Vibrio cholerae. Infect Immun. 2019;87(3):e00776–18. doi: 10.1128/IAI.00776-18.
  62. Jung Y.C., Lee M.A., Lee K.H. Role of Flagellin-Homologous Proteins in Biofilm Formation by Pathogenic Vibrio Species. mBio. 2019;10(4):e01793–19. doi: 10.1128/mBio.01793-19.
  63. Sinha-Ray S., Ali A. Mutation in flrA and mshA Genes of Vibrio cholerae Inversely Involved in vps-Independent Biofilm Driving Bacterium Toward Nutrients in Lake Water. Front Microbiol. 2017;8:1770. doi: 10.3389/fmicb.2017.01770.
  64. Del Peso Santos T., Alvarez L., Sit B., Irazoki O., Blake J., Warner B.R., et al. BipA exerts temperature-dependent translational control of biofilm-associated colony morphology in Vibrio cholerae. Elife. 2021;10:e60607. doi: 10.7554/eLife.60607.
  65. Hede N., Khandeparker L. Ecological Impacts of Aged Freshwater Biofilms on Estuarine Microbial Communities Elucidated Through Microcosm Experiments: A Microbial Invasion Perspective. Curr Microbiol. 2022;79(7):210. doi: 10.1007/s00284-022-02903-8.
  66. Selyanskaya N.A., Titova S.V., Menshikova E.A., Vodopyanov S.O., Kruglikov V.D. Influence of Cultivation Conditions on the Transmission of Antibiotic Resistance Genes in Vibrio cholerae. Antibiotics and Chemotherapy. 2024;69(9–10):4–10.doi: 10.37489/0235-2990-2024-69-9-10-4-10. (in Russian)
  67. Silva N.B.S., Marques L.A., Röder D.D.B. Diagnosis of biofilm infections: current methods used, challenges and perspectives for the future. J Appl Microbiol. 2021; 131(5):2148–2160. doi: 10.1111/apm.12689.

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download

Copyright (c) Eco-vector

License URL: https://eco-vector.com/for_authors.php#07
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ЭЛ № ФС 77 - 80652 от 15.03.2021 . Учредитель ООО "Эко-Вектор Ай-Пи" (ОГРН 1157847215338).