Количественный анализ фагоцитоза в цельной крови с применением двойного окрашивания и визуализации

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Фагоцитоз – важнейшая функция врождённого иммунитета человека и животных. Снижение способности к фагоцитозу связано со многими заболеваниями и старением иммунной системы. Определение фагоцитарной динамики клеток требует количественной оценки бактерий внутри и снаружи фагоцита. Хотя проточная цитометрия является наиболее распространённым методом оценки фагоцитоза, её использование не предполагает визуализации и прямой количественной оценки пространственной локализации бактерий. В данном исследовании применяли методы проточной цитометрии (сортировки) и конфокальной микроскопии в сочетании с «двухцветной» маркировкой бактерий Escherichia coli, которые использовали как объект фагоцитоза. Для обеспечения высокой производительности количественного и пространственного распознавания двухцветных E. coli, ассоциированных с фагоцитами, также применяли проточную цитометрию с визуализацией в потоке. На основании полученных данных было сделано предположение о важной роли удержания патогенов на поверхности миелоидных и лимфоидных клеток без последующей интернализации. Разработанный метод бактериальной конъюгации существенно повысил точность количественной и пространственной оценки фагоцитоза и может быть рекомендован в качестве вспомогательного подхода при использовании проточных цитометров с визуализацией для анализа фагоцитоза в цельной крови.

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

Е. В. Лысакова

Научно-технологический университет «Сириус»

Email: rybtsov.sa@talantiuspeh.ru

Научный центр генетики и наук о жизни, направление «Иммунобиология и биомедицина»

Россия, 354340, Сириус, Краснодарский край

А. Н. Шумеев

Научно-технологический университет «Сириус»

Email: rybtsov.sa@talantiuspeh.ru

Ресурсный центр клеточных технологий и иммунологии, Лабораторный комплекс

Россия, 354340, Сириус, Краснодарский край

С. А. Чувпило

Научно-технологический университет «Сириус»

Email: rybtsov.sa@talantiuspeh.ru

Научный центр генетики и наук о жизни, направление «Иммунобиология и биомедицина»

Россия, 354340, Сириус, Краснодарский край

В. С. Лактюшкин

Научно-технологический университет «Сириус»

Email: rybtsov.sa@talantiuspeh.ru

Ресурсный центр клеточных технологий и иммунологии, Лабораторный комплекс

Россия, 354340, Сириус, Краснодарский край

Н. А. Арсентьева

Санкт-Петербургский НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера

Email: rybtsov.sa@talantiuspeh.ru
Россия, 197101, Санкт-Петербург

М. Ю. Бобров

Научно-технологический университет «Сириус»

Email: rybtsov.sa@talantiuspeh.ru

Научный центр генетики и наук о жизни, направление «Иммунобиология и биомедицина»

Россия, 354340, Сириус, Краснодарский край

С. А. Рыбцов

Научно-технологический университет «Сириус»

Автор, ответственный за переписку.
Email: rybtsov.sa@talantiuspeh.ru

Ресурсный центр клеточных технологий и иммунологии, Лабораторный комплекс

Россия, 354340, Сириус, Краснодарский край

Список литературы

  1. Lancaster, C. E., Ho, C. Y., Hipolito, V. E., Botelho, R. J., and Terebiznik, M. R. (2019) Phagocytosis: what’s on the menu? Biochem. Cell Biol., 97, 21-29, https://doi.org/10.1139/bcb-2018-0008.
  2. Carneiro, V. M. A., Bezerra, A. C. B., Guimarães, M. D. C. M., and Muniz-Junqueira, M. I. (2012) Decreased phagocytic function in neutrophils and monocytes from peripheral blood in periodontal disease, J. Appl. Oral Sci., 20, 503-509, https://doi.org/10.1590/s1678-77572012000500002.
  3. Singh, R., Belchamber, K. B. R., Fenwick, P. S., Chana, K., Donaldson, G., Wedzicha, J. A., Barnes, P. J., Donnelly, L. E., and COPDMAP consortium (2021) Defective monocyte-derived macrophage phagocytosis is associated with exacerbation frequency in COPD, Respirat. Res., 22, 1-11, https://doi.org/10.1186/s12931-021-01718-8.
  4. Nakahashi-Oda, C., Fujiyama, S., Nakazawa, Y., Kanemaru, K., Wang, Y., Lyu, W., Shichita, T., Kitaura, J., and Shibuya, A. (2021) CD300a blockade enhances efferocytosis by infiltrating myeloid cells and ameliorates neuronal deficit after ischemic stroke, Sci. Immunol., 6, eabe7915, https://doi.org/10.1126/sciimmunol.abe7915.
  5. Kelley, S. M., and Ravichandran, K. S. (2021) Putting the brakes on phagocytosis: “don’t‐eat‐me” signaling in physiology and disease, EMBO Rep., 22, e52564, https://doi.org/10.15252/embr.202152564.
  6. Tang, Z., Davidson, D., Li, R., Zhong, M. C., Qian, J., Chen, J., and Veillette, A. (2021) Inflammatory macrophages exploit unconventional pro-phagocytic integrins for phagocytosis and anti-tumor immunity, Cell Rep., 37, https:// doi.org/10.1016/j.celrep.2021.110111.
  7. Uribe-Querol, E., Rosales, C. (2017) Control of phagocytosis by microbial pathogens, Front. Immunol., 8, 1368, https://doi.org/10.3389/fimmu.2017.01368.
  8. Gagnon, E., Duclos, S., Rondeau, C., Chevet, E., Cameron, P. H., Steele-Mortimer, O., Paiement, J., Bergeron, J. J. M., and Desjardins, M. (2002) Endoplasmic reticulum-mediated phagocytosis is a mechanism of entry into macrophages, Cell, 110, 119-131, https://doi.org/10.1016/s0092-8674(02)00797-3.
  9. Dempsey, L. A. (2019) Inhibiting phagocytosis, Nat. Immunol., 20.9, 1089-1089, https://doi.org/10.1038/s41590-019-0485-z.
  10. Cruz, F. M., Chan, A., and Rock, K. L. (2023) Pathways of MHC I cross-presentation of exogenous antigens, Semin. Immunol., 66, 101729, https://doi.org/10.1016/j.smim.2023.101729.
  11. Porpodis, K., Domvri, K., Zarogoulidis, P., Petridis, D., Tsirgogianni, K., Papaioannou, A., Hatzizisi, O., Kioumis, I., Liaka, A., Kikidaki, V., Lampaki, S., Organtzis, J., and Zarogoulidis, K. (2015) Roflumilast, a phosphodiesterase-4 inhibitor, induces phagocytic activity in Greek COPD patients, Int. J. Chron. Obstruct. Pulmon. Dis., 10, 1123-1128, https://doi.org/10.2147/COPD.S83205.
  12. Morais, T. C., Honorio-França, A. C., Fujimori, M., de Quental, O. B., Pessoa, R. S., França, E. L., and de Abreu, L. C. (2019) Melatonin action on the activity of phagocytes from the colostrum of obese women, Medicina, 55, 625, https://doi.org/10.3390/medicina55100625.
  13. Garcia‐Seyda, N., Seveau, V., Manca, F., Biarnes‐Pelicot, M., Valignat, M. P., Bajenoff, M., and Theodoly, O. (2021) Human neutrophils swim and phagocytise bacteria, Biol. Cell, 113, 28-38, https://doi.org/10.1111/boc.202000084.
  14. Li, W. (2013) Phagocyte dysfunction, tissue aging and degeneration, Ageing Res. Rev., 12, 1005-1012, https:// doi.org/10.1016/j.arr.2013.05.006.
  15. Ciabattini, A., Nardini, C., Santoro, F., Garagnani, P., Franceschi, C., and Medaglini, D. (2018) Vaccination in the elderly: the challenge of immune changes with aging, Semin. Immunol., 40, 83-94, https://doi.org/10.1016/j.smim. 2018.10.010.
  16. Robinson, J. P., Carter, W. O., and Narayanan, P. (1997) Functional assays by flow cytometry, in Manual of Clinical Laboratory Immunology. Volume Immune Cell Phenotyping and Flow Cytometric Analysis: Am. Soc. Microbiol. (Rose, Ed., Folds, J. D., Lane, H. C., and Nakumura, R., eds) 5, pp. 245-254.
  17. Serrander, L., Skarman, P., Rasmussen, B., Witke, W., Lew, D. P., Krause, K. H., Stendahl, O., and Nüße, O. (2000) Selective inhibition of IgG-mediated phagocytosis in gelsolin-deficient murine neutrophils, J. Immunol., 165, 2451-2457, https://doi.org/10.4049/jimmunol.165.5.2451.
  18. Lindner, B., Burkard, T., and Schuler, M. (2020) Phagocytosis assays with different pH-sensitive fluorescent particles and various readouts, Biotechniques, 68, 245-250, https://doi.org/10.2144/btn-2020-0003.
  19. Yang, F., Zhang, F., Yang, L., Li, H., and Zhou, Y. (2021) Establishment of the reference intervals of whole blood neutrophil phagocytosis by flow cytometry, J. Clin. Lab. Analysis, 35, e23884, https://doi.org/10.1002/jcla.23884.
  20. Jackaman, C., Tomay, F., Duong, L., Razak, N. B. A., Pixley, F. J., Metharom, P., and Nelson, D. J. (2017) Aging and cancer: the role of macrophages and neutrophils, Ageing Res. Rev., 36, 105-116, https://doi.org/10.1016/j.arr. 2017.03.008.
  21. DeLoid, G. M., Sulahian, T. H., Imrich, A., and Kobzik, L. (2009) Heterogeneity in macrophage phagocytosis of Staphylococcus aureus strains: high-throughput scanning cytometry-based analysis, PLoS One, 4, e6209, https://doi.org/ 10.1371/journal.pone.0006209.
  22. Laitinen, O. H., Kuusela, T. P., Kukkurainen, S., Nurminen, A., Sinkkonen, A., and Hytönen, V. P. (2021) Bacterial avidins are a widely distributed protein family in Actinobacteria, Proteobacteria and Bacteroidetes, BMC Ecol. Evol., 21, 1-14, https://doi.org/10.1186/s12862-021-01784-y.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Схема флуоресцентного мечения бактерий. E. coli конъюгировали FITC, а затем биотином для того, чтобы различать бактерии внутри и снаружи фагоцитирующих клеток. Показана последовательность проведения конъюгаций и контроль качества препарата E. coli. Рассчитывали концентрацию бактерий по оптической плотности (а) по заранее простроенной калибровочной кривой (б). После конъюгации E. coli с FITC проводили контрольную проточную цитометрию (в) для проверки однородности конъюгации (FITC+ 99,7%). После дальнейшей конъюгации E. coli с биотином проверяли однородность мечения в каналах AF405 и FITC – гомогенность конъюгации составила 98,7% (DP) для двух меток (г). Перед замораживанием маточной суспензии готовых бактерий подсчитывали их концентрацию по DIC и флуоресценции в заданном объёме, рассчитанном на основе известных параметров глубины фокуса и размера поля зрения (д)

Скачать (241KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Стратегия анализа и гейтирования для сортера Sony SH800: из единичных клеток (Singlets gate) выделяли лейкоциты (СD45+), далее эту популяцию сортировали по интенсивности флуоресценции и локализации бактерий (E. coli) на следующие категории: DN – двойная негативная популяция (нефагоцитировавшие клетки); Dim – клетки, флуоресценция которых не более чем на декаду выше, чем DN; Mid – клетки с умеренной интенсивностью флуоресценции (больше на декаду, чем у Dim); Bright – клетки с самой высокой интенсивностью флуоресценции; DP – двойная по FITC и AF405 позитивная популяция бактерий на поверхности (нижняя панель слева). Для анализа по субпопуляциям клетки гейтировали по гранулярности (SSC) и размеру (FSC) на гранулоциты (GR), моноциты (MO) и лимфоциты (LY). Расширенная информация по стратегии гейтирования приведена на рис. П2 Приложения

Скачать (354KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Схема эксперимента по сортировке фагоцитирующих популяций лейкоцитов (CD45+) и анализа отсортированных фракций на конфокальном микроскопе. Отсортированные популяции (а) были проанализированы с использованием конфокальной микроскопии (б), где DN – двойная негативная популяция (0 бактерий); Dim – клетки, интенсивность флуоресценции которых не более чем на декаду больше, чем у DN (автофлуоресценция – 0 бактерий); Mid – клетки с умеренной интенсивностью флуоресценции, в пределах декады выше, чем у Dim (1–5 бактерий внутри клетки); DP – популяция, двойная позитивная по FITC и AF405 (гетерогенная – бактерии внутри и/или на поверхности клетки). Наложение флуоресцентных изображений (FITC, AF405) и DIC обозначено как Merge (в). Красными цифрами на графике справа указаны средние значения количества E. coli внутри (IN) и снаружи (OUT) лейкоцитов, в скобках показан разброс данных. Индивидуальные изображения клеток – примеры клеток с различным количеством E. coli в популяциях (б, в). Число независимых экспериментов n = 3

Скачать (185KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Стратегия гейтирования для проточного цитометра с визуализацией Amnis FlowSight и обобщённое представление результатов визуализации. Цифрами обозначены процент клеток в популяции и количество бактерий внутри (IN) и снаружи (OUT) клеток. Для отдельных популяций было проанализировано до 352 клеток (рис. П3 Приложения). Число независимых экспериментов n = 3

Скачать (468KB)
Метаданные
6. Рис. 5. Локализация бактерий относительно клеток по результатам анализа встроенной программы Amnis и двойного окрашивания. а – Бактерии, которые детектировались программой как находящиеся снаружи клеток. 94,9% этих клеток действительно были позитивны и по FITC, и по AF405, то есть бактерии адгезированы на поверхности фагоцитов. б – Бактерии, которые детектировались программой как находящиеся внутри клеток. Однако 70,4% из этих клеток были позитивны и по FITC, и по AF405, что, согласно двойному окрашиванию, указывает на локализацию бактерий на поверхности клеток. в – Лимфоцитарный (LY) гейт. Хотя программа детектирует некоторые клетки в популяции лимфоцитов как фагоцитирующие, все 1,28% клеток, согласно двойному окрашиванию, находились на поверхности. Верхние панели иллюстрируют (слева направо) каналы: FITC (E. coli), Brightfield 1, AF405 (biotin-streptavidin, E. coli), Brightfield 2 и наложение всех каналов. Правые панели визуализируют клетки, показанные в виде точек на графиках проточной цитометрии. Синей линией дана масштабная линейка для изображений клеток. Образцы поклеточного анализа изображений показаны на рис. П3 Приложения

Скачать (209KB)
Метаданные
7. Приложение
Скачать (956KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2024